红外光辅助萃取-HPLC法测定玄参中肉桂酸和哈巴俄苷的含量

黄滔敏，陈念祖，王东蕾，赖永华，闫晶超，顾纪峰（复旦大学附属眼耳鼻喉科医院药剂科，上海市 200031）

红外光辅助萃取-HPLC法测定玄参中肉桂酸和哈巴俄苷的含量

黄滔敏＊，陈念祖#，王东蕾，赖永华，闫晶超，顾纪峰（复旦大学附属眼耳鼻喉科医院药剂科，上海市 200031）

目的：建立测定玄参中肉桂酸和哈巴俄苷含量的方法。方法：采用红外光辅助萃取-高效液相色谱法。色谱柱为Diamonsil C18（200mm×4.6mm，5μm），流动相为1%乙酸溶液-甲醇（55∶45），柱温为25℃，流速为1mL·min-1，检测波长为278nm，以外标法计算含量。红外光辅助萃取条件的溶剂为甲醇-水（50∶50），提取时间为5min。结果：肉桂酸和哈巴俄苷的检测浓度均在5～100µg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r均为0.9999）；二者平均回收率分别为101.7%和103.2%，RSD分别为0.71%和0.93%（n＝6）。结论：本方法简便、准确，适用于分析测定玄参中肉桂酸和哈巴俄苷的含量。

红外光辅助萃取；高效液相色谱法；玄参；肉桂酸；哈巴俄苷；含量测定

玄参为常用中药，具有凉血滋阴、泻火解毒之功效，用于治疗目赤、咽痛、舌绛烦渴、津伤便秘、热病伤阴、温毒发斑、骨蒸劳嗽、瘰疬、白喉、痈肿疮毒等证。《中国药典》记载玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根。哈巴俄苷为玄参中含量较高的成分，文献报道其具有抗慢性炎症、降压、镇痛、解痉、抗乙肝病毒以及免疫促进作用[1～3]。肉桂酸为玄参中另一重要成分，具有轻泻作用[4，5]。

文献报道分析测定玄参中肉桂酸和哈巴俄苷含量的方法较多的是超声、回流提取和索氏提取等方法。这些方法的缺点是耗时、消耗有机溶剂，且操作烦琐。国内、外尚未见用红外光辅助萃取作为前处理方法分析玄参中肉桂酸和哈巴俄苷含量的文献报道。笔者采用红外光辅助萃取-高效液相色谱法测定玄参中肉桂酸和哈巴俄苷的含量，方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，适用于玄参的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1100型HPLC仪，包括G1322A Degasser在线脱气机、G1311A QuartPump四元泵、G1316A Column柱温箱、G1314AVWD紫外检测器、惠普色谱工作站及20µL手动进样系统（美国惠普公司）；Direct-Q纯净水发生器（美国Millipore公司）；B5500s-MTH超声波清洗器（上海Branson超声波仪器厂）；275W红外灯泡（上海申游照明电器有限公司）。

玄参对照药材（批号：1008-200003）、肉桂酸对照品（批号：110786-200503）、哈巴俄苷对照品（批号：111730-200604）均由中国药品生物制品检定所提供；冰乙酸（分析纯，中国振亚化工厂，批号：070514）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（200mm×4.6mm，5μm）；流动相：1%乙酸溶液-甲醇（55∶45）；柱温：25℃；流速：1mL·min-1；检测波长：278nm；进样量：20μL。

2.2 混合对照品贮备液的制备

分别精密称取肉桂酸和哈巴俄苷对照品12.5mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成2种成分浓度均为500µg·mL-1的混合对照品贮备液，置于4℃冰箱内贮藏。再用甲醇-水（50∶50）稀释至不同的浓度，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取药材样品适量，70℃干燥48h，粉碎。精密称取药材粉末1.0g，置100mL圆底烧瓶中，加入40mL甲醇-水（50∶50），用红外光加热5min，整个过程通冷凝水冷却蒸汽。提取完成后将溶液用0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，待测。

2.4 系统适用性试验

取上述混合对照品贮备液、供试品溶液各20μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。结果，2种对照品与其他成分分离良好，理论板数均＞5000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品贮备液；B.供试品溶液；1.肉桂酸；2.哈巴俄苷Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed control stock solution；B.sample solution；1.cinnamic acid；2.harpagoside

2.5 线性关系考察

精密吸取上述混合对照品贮备液适量，用甲醇-水（50∶50）稀释制成含肉桂酸和哈巴俄苷浓度分别为5、10、25、50、75、100µg·mL-1的混合对照品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以对照品浓度（X，µg·mL-1）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，计算得肉桂酸的回归方程为Y＝166.2167X－22.5037（r＝0.9999）、哈巴俄苷的回归方程为Y＝48.1292X－0.2258（r＝0.9999）。结果表明，肉桂酸和哈巴俄苷的检测浓度均在5～100µg·mL-1范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.6 检测限和定量限确定

按照信噪比（S/N）＝3确定肉桂酸和哈巴俄苷的检测限分别为0.02µg·mL-1和0.6µg·mL-1；按照S/N＝10确定肉桂酸和哈巴俄苷的定量限分别为0.08µg·mL-1和2.0µg·mL-1。

2.7 精密度试验

取上述肉桂酸和哈巴俄苷均为10、50、100µg··mL-13个浓度的混合对照品溶液适量，分别连续进样5次，计算。结果，肉桂酸峰面积的RSD分别为1.25%、1.34%、1.24%（n＝5），哈巴俄苷峰面积的RSD分别为1.39%、1.40%、0.84%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批玄参粉末适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。结果，肉桂酸和哈巴俄苷平均含量的RSD分别为0.85%和1.71%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

准确称取已测知含量的玄参样品粉末1g，共6份，分别精密加入混合对照品溶液（含肉桂酸0.350mg、哈巴俄苷1.400mg），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab1 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、32h进样测定。结果，肉桂酸和哈巴俄苷峰面积的RSD分别为1.37%和2.46%（n＝6），表明供试品溶液在32h内基本稳定。

2.11 样品含量测定

取玄参对照药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述方法进样检测。结果，玄参对照药材中肉桂酸和哈巴俄苷的含量分别为（0.37±0.002）mg·g-1和（1.40±0.007）mg·g-1（n＝3）。本方法测得的含量同文献报道[3，4]的含量测定数据比较接近，说明本方法适用于玄参中肉桂酸和哈巴俄苷含量的测定。

3 讨论

红外光辅助萃取技术是新兴发展起来的一种中药前处理方法，其原理是：红外光加热过程是高能量的光穿透萃取介质物料，最终到达物料的内部维管束和腺泡系统的过程。物料在吸收红外光能量以后，细胞内部温度迅速升高，致使细胞内压超过细胞壁最大承受力，于是细胞壁破裂，胞内目标成分自由流出。通过分离、提纯，最终获得目标成分。与传统的提取技术相比，红外光辅助萃取具有设备简单、应用范围广泛、萃取效率较高、可预处理批量样品、省时、省试剂等优点。该方法可以用来前处理玄参，并且能简便、准确地测定玄参中肉桂酸和哈巴俄苷的含量。

笔者考察了水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇作为提取溶剂对肉桂酸和哈巴俄苷提取率的影响，发现50%甲醇提取率较高，故选其作为本试验提取溶剂。红外光辅助萃取时间的加长会提高提取效率，但萃取时间过长，会使提取物发生分解，使提取效率降低，故笔者考察了提取时间（1、2、5、10min），结果发现在5min时提取效率最高。因此，本试验中红外光辅助萃取的优化条件为：甲醇-水（50∶50）作为提取溶剂，红外光辅助提取1次，提取时间为5min。

为了验证红外光辅助萃取的优势，笔者将红外光辅助萃取和超声波提取法[6]进行了比较。红外光辅助萃取的供试品溶液按前文所述方法制备；超声波提取的条件为40mL溶剂（50%甲醇），超声时间为30min，0.45µm微孔滤膜滤过。两者都在相同的色谱条件下进行检测。结果，在相同条件下，红外光辅助萃取的提取效率比超声波提取法高，而且红外光辅助萃取的时间比超声波提取明显缩短，从而验证了红外光辅助萃取具有较高的提取率、溶剂用量少、样品需求量低、提取时间短等显著优点。

[1] 张洪霞，宋金玉，赵荣淑，等.RP-HPLC法同时测定玄参中肉桂酸、哈巴俄苷的含量[J].沈阳药科大学学报，2006，23（8）：507.

[2] 李振东，徐位良，罗娇艳.HPLC法测定玄麦甘桔颗粒中哈巴俄苷与肉桂酸含量[J].广东药学院学报，2008，24（2）：130.

[3] 张发科，吕青涛，张兆旺.HPLC法研究不同炮制工艺对玄参中哈巴俄苷和肉桂酸含量的影响[J].化学分析计量，2006，15（6）：51.

[4] 白志川.不同产地与加工方法玄参中肉桂酸的含量测定[J].西南农业大学学报（自然科学版），2006，28（3）：425.

[5] 肖冰梅，裴 刚，曾 夷.HPLC法测定不同产地玄参的肉桂酸含量[J].中华中医药学刊，2008，26（1）：117.

[6] 罗傲雪，范益军，罗傲霜，等.不同提取方法对石斛多糖含量测定的影响[J].中国药房，2010，21（7）：601.

Content Determination of Cinnamic Acid and Harpagoside inScrophularia ningpoensisby Infrared Heating Assisted Extraction-HPLC

HUANG Tao-min，CHEN Nian-zu，WANG Dong-lei，LAI Yong-hua，YAN Jing-chao，GU Ji-feng
（Dep.of Pharmacy，Eye&ENT Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 200031，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the content determination of cinnamic acid and harpagoside inScrophularia ningpoensis.METHODS：Infrared heating assisted extraction-HPLC（IHAE-HPLC）was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18（200mm×4.6mm，5μm）column with 1%acetic acid solution-methanol（55∶45）as mobile phase at flow rate of 1mL·min-1.The column temperature was set at 25℃.And the detection wavelength was 278nm.The contents of cinnamic acid and harpagoside were calculated using external standard method.Cinnamic acid and harpagoside was extracted by IHAE-HPLC using methanol-water（50∶50）as solvent with extraction time of 5min.RESULTS：The linear range for cinnamic acid and harpagoside were 5～100µg·mL-1（r＝0.9999）.The average recoveries of cinnamic acid and harpagoside were 101.7%（RSD＝0.71%，n＝6）and 103.2%（RSD＝0.93%，n＝6）.CONCLUSION：The method is simple and accurate.It is adapted to determine and analyze the content of cinnamic acid and harpagoside inS.ningpoensis.

Infrared heating assisted extraction；HPLC；Scrophularia ningpoensis；Cinnamic acid；Harpagoside；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2011）19-1796-03

＊药师，硕士。研究方向：新药质量标准制定及体内外方法学研究。E-mail：tmhuang@fdeent.org

#通讯作者：副主任药师。研究方向：医院制剂。电话：021-64373955。E-mail：nianzuch@163.com

2010-05-13

2011-02-21）