五味子粗多糖提取物对大鼠肝纤维化的防治作用研究Δ

许珂玉，肖建英

（辽宁医学院，锦州市 121000）

五味子粗多糖提取物对大鼠肝纤维化的防治作用研究Δ

许珂玉＊，肖建英#

（辽宁医学院，锦州市 121000）

目的：研究五味子粗多糖提取物对复合病因诱导的大鼠肝纤维化的防治作用。方法：实验分为6组，即正常对照（生理盐水）、模型（生理盐水）、秋水仙碱（0.1mg·kg-1）和五味子粗多糖提取物高、中、低剂量（400、200、100mg·kg-1）组。腹腔注射CCl4复制大鼠肝纤维化模型；灌胃给药。检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性，肝匀浆丙二醛（MDA）和羟脯氨酸（HOP）的含量以及超氧化物岐化酶（SOD）的活性；形态学上观察肝组织病理学变化，用细胞图像分析系统（CIAS）对肝纤维化进行半定量。结果：与正常对照组比较，Massion染色显示模型组肝纤维化明显，有大量胶原纤维存在，肝小叶结构紊乱，血清ALT和AST显著升高，肝中MDA和HOP含量显著升高，SOD活性显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，各用药组大鼠血清ALT和AST显著降低；肝中MDA含量下降，SOD活性升高，具有显著性差异（P＜0.01），并呈剂量依赖效应；肝HOP含量及胶原面积百分比显著下降（P＜0.01）。结论：五味子多糖可减轻肝损害、肝脂质过氧化和肝纤维化的作用。

五味子粗多糖；复合因素；肝纤维化

肝纤维化是多种慢性肝病的重要病理阶段，也是肝硬化的病理基础。肝纤维化的病理原因是肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC）活化和增殖，导致胶原合成过量，降解相对不足，从而使以胶原纤维为主的细胞外基质合成增多并过度沉积所致[1]。

近年来对肝纤维化发生机制的研究表明，肝纤维化是一种可以逆转的病理改变。我国是一个肝病高发国家，因此采取积极合理的治疗措施，可以逆转肝纤维化的进程，从而达到缓减甚至治愈肝纤维化的目的，对防治肝硬化的发生、发展显得尤为重要和紧迫[2]。

五味子为木兰科五味子属植物，具有补肾、益气、生津、固涩等功效，临床用于治疗久咳虚喘、梦遗滑精、津伤口渴、气短脉虚、内热消渴和心悸失眠等证。五味子成分复杂，药理作用多样，现代药理学研究证明，其不仅对中枢神经系统、心血管系统、免疫系统等均有调节作用，还具有抑制肿瘤、抗氧化、抗衰老等方面作用[3]。笔者研究五味子粗多糖提取物对复合病因诱导的肝纤维化的防治作用，以为五味子防治肝纤维化的临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CH2000型生化自动分析仪、UV1601型紫外分光光度仪、LEICARM21-35超薄切片机（日本岛津公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；细胞图像分析仪（CIAS，北京大恒图像有限公司）。

1.2 试药

北五味子（辽宁中医药大学提供，由辽宁医学院肖建英教授鉴定为真品）；乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（HOP）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；所有试剂均为国产分析纯。

1.3 动物

SPF级健康Wistar大鼠90只，♀♂兼半，体重（200±20）g，由中国医科大学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SYXK（辽）2008-0004）。

2 方法

2.1 五味子多糖纯化

取北五味子果实500g，清水洗净，研磨粉碎后加水4.0L，微沸煎煮1h，过滤，滤渣加水2.5L，煎煮1h，过滤，合并提取液，加热浓缩，加入3倍量900mol·L-1乙醇，放置24h，抽滤，乙醇和丙酮交替沉淀法纯化，参考文献[4]方法并加以改进，得到浅棕色粗多糖。将粗多糖溶解于水，用Seveg法除去蛋白，直至中间层无变性蛋白为止，加入10g·L-1活性炭脱色，抽滤，滤液装于透析袋中，透析48h，除去无机离子，得微黄色多糖纯化物。再将纯化物经Sephadex G-200柱层析，NaCl溶液洗脱，平衡胶柱，透析，浓缩，冻干，以葡聚糖溶液作标准曲线，用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。样品含糖量约为60.3mg·g-1。

2.2 肝纤维化模型制备与分组

参照Wasser方法[5]改进而成。sc花生油配制的10%CCl4，首次剂量为0.5mL·100mg-1，以后为0.3mL·100mg-1，每周2次，共4周。实验分为6组，每组15只，即正常对照（等容生理盐水）、模型（等容生理盐水）、秋水仙碱（0.0025%，0.1mg·kg-1）和五味子多糖高、中、低剂量（400、200、100mg·kg-1）组。ig给药，给药容积为0.5mL·100mg-1，每天1次，连续2周。

2.3 血清ALT、AST活性的测定

断头取血，静置30min，1500r·min-1离心 5min，分离血清，用生化自动分析仪按试剂盒说明书测定血清ALT、AST的活性。

2.4 肝匀浆MDA、HOP含量和SOD活性的测定

取大鼠肝组织，用生理盐水制成10%的肝匀浆，4000r·min-1离心10min，取上清分别按试剂盒说明书操作，测定MDA、HOP含量和SOD活性。

2.5 组织病理学观察

取肝组织2.5mm左右厚度，4%甲醛固定24h，冲洗24h，梯度脱水，香柏油透明12h，浸蜡，包埋，贴块，连续切片。分别进行HE和Massion染色，观察肝组织病理变化，

2.6 胶原半定量分析

每组每只大鼠做1个组织块，连续切片，每隔10张取1张，每个组织块取30张，作Massion染色；每张切片40倍光镜下随机取5个视野，应用CIAS测量胶原纤维面积并求其平均值。

2.7 统计学方法

数据以±s表示，两样本均数比较用t检验。数据处理均用SPSS12.0for Windows统计学软件包完成。

3 结果

3.1 各组大鼠血清ALT、AST活性测定

正常对照组肝血清ALT与AST在正常范围值内；模型组血清ALT与AST显著高于正常值（P＜0.01），表明肝细胞受损严重。高、中、低剂量五味子多糖能显著降低模型大鼠ALT及AST水平（P＜0.01），随着药物浓度增加，降低效果显著，且与秋水仙碱组比较效果较好。说明中药治疗尚需较缓慢过程，需要逐步改善。大鼠血清ALT和AST活性见表1。

表1 大鼠血清ALT和AST活性Tab1 Activities ofALT andAST in rat serum

3.2 各组大鼠肝MDA、HOP含量和SOD活性测定

与正常对照组比较，模型组大鼠肝MDA含量显著增加，SOD活性显著下降，HOP含量显著增加（P＜0.01），表明CCl4对肝细胞的损伤主要是肝过氧化脂质产生过多造成的。高、中、低剂量五味子多糖能显著降低模型大鼠MDA、HOP含量，提高SOD活性（P＜0.01）。大鼠肝组织MDA、HOP含量和SOD活性见表2。

3.3 组织病理学观察

正常对照组大鼠肝小叶结构完整，无变形、坏死、炎细胞浸润及纤维组织增生。模型组大鼠肝小叶被破坏，肝细胞充满脂滴，有程度不等、范围不一的肝细胞坏死区，坏死区中央和周围有大量炎细胞浸润，并形成较宽的以胶原纤维为主要成分的纤维间隔，被染成绿色，且多数胶原纤维分隔、包绕肝小叶形成假小叶。五味子多糖高、中、低剂量组较模型组纤维间隔窄、假小叶形成少，与秋水仙碱组比较治疗效果更好。大鼠肝组织病理切片见图1。

表2 大鼠肝组织MDA、HOP含量和SOD活性Tab2 Contents of MDA and HOP and SOD activity in liver tissue in each group

图1 大鼠肝组织病理切片A.正常对照组；B.模型组；C.五味子多糖高剂量组；D.秋水仙碱组Fig1 Pathological section of hepatic tissue of ratsA.normal control group；B.model group；C.Polysaccharides from S.chinensis high-dose group；D.colchicine group

3.4 各组大鼠肝纤维化测定

模型组胶原纤维面积远高于正常对照组（P＜0.01），五味子多糖高、中、低剂量组胶原纤维面积与模型组比较显著改善（P＜0.01）。大鼠肝胶原纤维面积密度比较见表3。

表3 大鼠肝胶原纤维面积密度比较Tab3 Area density of hepatic collagen fiber of rats

4 讨论

各种病因（如病毒、CCl4、乙醇、高胆固醇等）均可引起肝脏损伤，并继发纤维化的病理过程。本实验研究五味子多糖对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用。CCl4在肝脏经还原活化产生·CCl3，后者与模型结构中磷脂的不饱和脂肪酸结合，产生脂质过氧化反应，使肝细胞膜、线粒体膜、微粒体膜损伤[5]。研究采用血清ALT和AST活性作为检测肝细胞损伤的灵敏指标，MDA含量和SOD活性反映细胞脂质过氧化程度，HOP含量反映肝纤维化状况。结果表明，正常肝组织切片颜色红润，无颗粒沉积，小叶间有少量胶原纤维；模型组肝颜色变暗，有颗粒沉积，小叶间和汇管区有大量的胶原纤维，纤维将肝小叶重新分割形成假小叶。肝功能检测发现，模型组与正常对照组比较血清ALT和AST活性明显增高，组间比较具有显著性差异（P＜0.01），表明模型组肝功能损伤严重。由于脂质过氧化过程会产生大量的脂质过氧化物，主要产物是MDA，所以MDA含量代表脂质过氧化的程度；而SOD能够催化自由基的歧化反应，具有清除自由基作用，二者是衡量脂质过氧化过程的重要指标。结果表明，模型组与正常对照组比较MDA含量增加，SOD活性下降。五味子多糖高、中、低剂量组和秋水仙碱组与模型组比较，从病理切片上可见，肝较红润，小叶间纤维间隔变窄，假小叶少见，颗粒沉着减少，MDA含量降低，SOD活性升高（P＜0.01），并呈剂量依赖效应，表明五味子多糖具有抗氧化作用，可以替代秋水仙碱。随着肝损伤，肝细胞受损失，肝功能异常，肝将代偿性增生，胶原纤维将大量生成，导致胶原纤维的生成大于分解，打破了动态平衡状态，引起肝纤维化和假小叶的形成。本研究选用HOP及形态学作为检测肝纤维化指标，肝纤维化时HOP明显升高。五味子多糖高、中、低剂量组和秋水仙碱组与模型组比较HOP含量显著减低，其中五味子多糖低剂量组与秋水仙碱组治疗效果有差别，但无显著性差异。通过CIAS对胶原纤维密度进行半定量分析表明，五味子多糖高、中、低剂量组和秋水仙碱组与模型组比较胶原面积明显减少，虽然没有完全恢复肝纤维化，但能明显改善。

综上所述，五味子多糖具有减轻肝纤维化、抗氧化作用。由于五味子多糖副作用小，治疗效果不低于秋水仙碱，因此可考虑将其作为临床肝纤维化治疗的辅助性药物。

（感谢各位老师、学长对本研究课题的指导!同时也感谢辽宁中医药大学的同学们对笔者的大力支持!）

[1] 贾曾荣，余 震，陈必成，等.大豆异黄酮抗肝纤维化的实验研究[J].中国肝胆外科，2009，15（10）：758.

[2] 赵治友，林庚庭，张俊杰，等.加味桃核承气汤对四氯化碳肝纤维化大鼠α-SMA表达的影响[J].中华中医药，2008，23（11）：1034.

[3] 魏景文.五味子药理研究新进展[J].天津药学，2009，21（5）：55.

[4] 刘 娜，朴惠善.北五味子茎藤多糖的提取和含量测定[J].延边大学学报，2010，33（1）：29.

[5] 齐 彦，郭丽新，周迎春，等.五味子对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的作用研究[J].中医药学报，2009，37（4）：26.

Preventive Effects of Polysaccharides fromSchisandra chinensison Liver Fibrosis in Rats

XU Ke-yu，XIAO Jian-ying
（Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

OBJECTIVE：To investigate preventive effects of polysaccharides fromSchisandra chinensison multiple factors-induced liver fibrosis in rats.METHODS：Rats were randomly divided into six groups：normal control group（normal saline），model group（normal saline），high-dose，medium-dose and low-dose groups（colchicine 0.1mg·kg-1，polysaccharides fromS.chinensis400，200，100mg·kg-1）.Liver fibrosis model was established by intraperitoneal administration of CCl4and given relevant medicine via i.g.The activities of ALT and AST in serum of rats were determined and the contents of MDA and HOP were also detected as well as the activity of SOD.The pathological change of liver tissue was observed and the semi-quantitative analysis of liver fibrosis was conducted using CIAS.RESULTS：Compared with normal group，Massion staining showed obvious liver fibrosis in model group.There was collagenic fiber and lobular disorder.The serum levels of ALT and AST and the contents of MDA and HOP increased significantly，and the activity of SOD decreased significantly（P＜0.01）.Compared with model group，the serum levels of ALT and AST in treatment groups decreased significantly.The content of MDA decreased while the activity of SOD increased，there was significant difference in dose-dependent manner（P＜0.01）.The percentage of HOP and collagen declined（P＜0.01）.CONCLUSION：Polysaccharides fromS.chinensiscan relieve liver damages，lipid peroxidation and liver fibrosis

Polysaccharides fromSchisandra chinensis；Multiple factors；Liver fibrosis

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1743-03

Δ辽宁省教育厅基金资助项目（2009A469）

＊副教授，博士研究生。研究方向：中药与肿瘤治疗。电话：0416-4673253。E-mail：keyuxu2002@sina.com

#通讯作者：教授，博士。研究方向：甲状腺肿瘤。电话：0416-4673253。E-mail：xiaojianying@yahoo.com.cn

2010-10-12

2011-01-07）