龙胆碱在大鼠体内的药动学特征及透过血脑屏障的研究Δ

刘学伟，刘天宇，刘树民，汤 青

（黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨市 150040）

龙胆碱在大鼠体内的药动学特征及透过血脑屏障的研究Δ

刘学伟＊，刘天宇，刘树民#，汤 青

（黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨市 150040）

目的：利用高效液相色谱（HPLC）法研究龙胆碱的药动学特征及判断其是否透过血脑屏障。方法：大鼠经尾静脉注射龙胆碱后，断尾取血，离心后分离血清，经固相萃取柱（SPE）沉淀蛋白。色谱柱为Diamonsil-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-水（梯度洗脱），全波长扫描，流速为1.0mL·min-1。在此基础上，采用腹腔注射龙胆碱后断头取脑，用HPLC法测定脑中龙胆碱含量，依据龙胆碱给药剂量与脑内含量的值推算龙胆碱是否透过血脑屏障。结果：龙胆碱线性回归方程为A＝2.445×107c－44388.6（r＝0.9997，n＝6），表明龙胆碱血清浓度在3.125×10-4～0.1mg·mL-1范围内与峰面积积分值线性关系良好；最低检出浓度为0.02μg·mL-1；主要药动学参数t1/2a＝8.62min，t1/2β＝116.64min，AUC＝3.57mg·min·mL-1，CL（s）＝28.05mg2·kg-1·mL-1·min-1。在大鼠脑内能检测到龙胆碱，且其含量随给药剂量增加而增加。结论：静脉注射龙胆碱的大鼠其体内药动学呈开放二室模型；龙胆碱能透过血脑屏障。

龙胆碱；药动学；高效液相色谱法；血脑屏障

龙胆是龙胆科植物龙胆、三花龙胆、条叶龙胆或坚龙胆的干燥根及根茎，具有清热燥湿、泻肝定惊的功效。一直以来，龙胆中主要成分龙胆苦苷被认为是龙胆的主要活性成分，具有多方面的药理作用[1]。近年来研究表明，龙胆苦苷在体内经肠道菌群作用后会部分生成龙胆碱等代谢产物[2]，因此有人推测，龙胆的药理作用可能是龙胆苦苷与龙胆碱的协同作用。国内一些研究也证实龙胆碱具有抗炎[3，4]、降血压[5]及升血糖等作用[6]。本课题组也证实龙胆碱具有明显的抗惊厥及脑损伤保护作用，能延长惊厥潜伏期，缩短惊厥持续时间，并缓解惊厥所致的神经元损伤[7，8]。因此，明确龙胆碱能否透过血脑屏障是补充其抗惊厥作用的重要依据。此外，有关龙胆碱的药动学研究尚未见报道，阐明龙胆碱药动学特征，对进一步研究龙胆碱也具有积极的意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

2695 型高效液相色谱（HPLC）仪、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；Milli-Q型去离子水机（法国Millipore公司）；KDC-160HR型高速冷冻离心机（安徽科大创新股份有限公司）；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机、AGBS124S型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

龙胆碱标准品（笔者自制[9]，经 UV、IR、1H-NMR、13CNMR、MS鉴定；经HPLC检测含量＞98.4%）；甲醇为色谱纯，水为实验室自制超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

清洁级SD大鼠43只，♂，体重（200±20）g，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供（动物质量合格证号：01-10-2号）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水（在20min内从40∶60到60∶40，梯度洗脱），全波长扫描；流速：1.0mL·min-1。

2.2 标准溶液的制备

精密称取龙胆碱标准品1.0mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定量至刻度，配制质量浓度为0.2mg·mL-1的溶液，依次用甲醇倍比稀释成系列浓度，4℃贮藏，备用。

2.3 血清样品的处理

大鼠经剪尾取血0.5mL，置于1mL离心管中，8000r·min-1离心15min，离心2次，分离血清，－20℃贮藏，备用。取上述血清0.1mL，加入4%H3PO4溶液0.1mL，涡旋60s混匀，用微量移液器分多次压入SPE柱（避免带入气泡），依次用1mL水、1mL 5%甲醇冲去杂质，100%甲醇洗脱，定容至1mL，挥干，并用0.2mL甲醇溶解，经0.45μm有机相微孔滤膜滤过，取滤液10μL进HPLC测定含量。SPE柱的活化方法为：依次用1mL甲醇、1mL蒸馏水冲洗2次，最后压出全部液体。

2.4 药动学研究

取SD♂健康大鼠15只，随机均分为3组。给药前24h禁食不禁水，经尾iv龙胆碱，剂量分别为10、50、100mg·kg-1，并于给药后 5、15、30、60、120、240、360、480min剪尾取血 0.5mL，置于1mL离心管中，按“2.3”项下方法操作，由标准曲线方程计算龙胆碱的血药浓度。

2.5 龙胆碱透过血脑屏障研究

2.5.1 脑内龙胆碱最大检测浓度出现时间的确定 取SD♂健康大鼠18只，随机均分为9组。给药前24h禁食不禁水，ip龙胆碱（100mg·kg-1）。分别于给药前与给药后5、15、30、60、120、240、360、480min先尾静脉取血，处理同“2.3”项下方法；再用20%乌拉坦麻醉，开胸腔后心脏灌流150mL生理盐水以冲去脑中血液，断头，于冰浴上取脑，脑匀浆后取上清液按“2.3”项下SPE小柱处理样品法操作。由标准曲线方程计算龙胆碱的血药浓度及脑中含量。2.5.2龙胆碱是否透过血脑屏障的研究 取SD♂健康大鼠10只，随机均分为5组。给药前24h禁食不禁水，ip龙胆碱，剂量分别为10、25、50、75、100mg·kg-1。按“2.5.1”项下得出的最佳时间于给药后用20%乌拉坦麻醉，开胸腔，心脏灌流150mL生理盐水以冲去脑中残留血液，断头，于冰浴上取脑，脑匀浆后取上清液按“2.3”项下SPE柱处理样品法操作。由标准曲线方程计算龙胆碱在脑中的含量。

2.6 标准曲线的制备

精密移取100μL空白血清，置于1mL离心管中，分别精密加入“2.2”项下龙胆碱系列标准溶液100μL，使龙胆碱浓度分别为0.1、0.05、0.025、0.0125、6.25×10-3、3.125×10-3、3.125×10-4mg·mL-1，按“2.3”项下方法操作，进样分析。以血浆中龙胆碱的浓度（c）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，进行线性回归。

3 结果

3.1 色谱行为

龙胆碱与其他干扰组分分离效果良好，无杂质峰干扰，在此色谱条件下，tR为8.1min左右，与相邻色谱峰分离度均＞1.5。色谱见图1。

3.2 线性范围

线性回归方程为A＝2.445×107c－44388.6（r＝0.9979，n＝6）。表明龙胆碱检测浓度在3.125×10-4～0.1mg·mL-1范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。最低定量浓度为0.3125μg·mL-1，最低检出浓度为0.02μg·mL-1（S/N＝3）。

3.3 回收率与精密度试验

精密移取100μL空白血清，置于1mL离心管中，共15份，分为3组，各组分别加龙胆碱标准溶液配制成0.005、0.025、0.05mg·mL-1的3种已知浓度的血清样品，同“2.3”项下方法操作，进行方法的相对回收率和精密度试验。回收率与精密度试验结果见表1。

表1 回收率与精密度试验结果Tab1 Results of sample recovery and precision tests

3.4 稳定性试验

考察样品冻融3周期及经处理后的血浆样品在室温避光放置24h的稳定性。按“2.6”项下方法分别配制龙胆碱浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、6.25×10-3、3.125×10-3、3.125×10-4mg·mL-1的血清质量控制样品（n＝3），分别在不同条件下贮藏，测得冻融1周期血浆浓度的相对偏差RE[RE＝（实测值－理论值）/理论值]在±5.18%范围内；冻融3周期血浆浓度的RE在±6.05%范围内；经处理后的血浆样品在室温避光放置24h后的血浆浓度的RE在±4.25%范围内。结果表明，血清样品的分析方法符合有关规范要求。

3.5 药动学参数计算及结果

将测得的血药浓度数据用3p97药动学程序拟合计算，结果表明，龙胆碱在大鼠体内的药动过程符合二室模型。龙胆碱在大鼠体内的主要药动学参数见表2；大鼠给药后龙胆碱平均血药浓度-时间曲线见图2。

表2 龙胆碱在大鼠体内的主要药动学参数Tab2 Main pharmacokinetic parameters of gentianine in rats

图2 大鼠给药后龙胆碱平均血药浓度-时间曲线（n＝3）Fig2 Mean plasma concentration-time curves of gentianine in rats with intravenous administration（n＝3）

3.6 龙胆碱在脑内最大检测含量出现时间的确定

由血药浓度-时间曲线及脑内浓度-时间曲线（图3）可以看出，ip龙胆碱后最大血药浓度出现时间为给药后15min，而脑中最大含量出现时间为给药后30min。龙胆碱浓度随时间变化见图4。

图3 不同剂量龙胆碱在脑内浓度变化Fig3 The content of gentianine in cerebral tissue with different dose administration of it

3.7 龙胆碱透过血脑屏障的确定

图4 龙胆碱浓度随时间变化图A.血药浓度随时间变化；B.脑内浓度随时间变化Fig4 Changes of gentianine concentration with timeA.plasma concentration of gentianine changes with time；B.the content of gentianine in cerebral tissue changes with time

ip不同剂量龙胆碱30min后，各组大鼠脑中龙胆碱浓度随剂量增加而增加，因此可以排除脑中残留血液的影响，表明龙胆碱能够透过血脑屏障。不同剂量龙胆碱在脑内浓度变化见图3。

4 讨论

药动学的首选动物应与药效学或毒理学研究一致。依据前期实验，本研究选择的动物是大鼠。笔者设计了3个剂量组，以了解龙胆碱在体内的动力学过程是线性动力学还是非线性动力学，因为不同的动力学模型处理方法不同。为了减少不同动物之间的差异，取血应从同一只动物连续取血，为保证多次取血并使动物能够清醒和存活，故确定尾静脉取血。

本研究进行了血清处理方法的考察。在空白血清中加入已知含量的龙胆碱，分别采用甲醇、乙腈、高氯酸处理血清、沉淀蛋白、离心后取上清液进HPLC测定含量，以回收率为指标，结果都不理想。后来采用固相萃取柱处理血清，并分别考察了不同类型SPE柱和不同的洗脱条件，最终确定了文中血清处理方法，回收率在90%以上。

物质透过血脑屏障主要有4条途径：水溶性小分子直接经细胞间隙扩散；脂溶性分子的跨膜扩散；特异受体介导的胞饮作用；特异载体通道和酶系统的激活[10]。药物透过血脑屏障的能力通常与药物本身的相对分子质量、脂溶性、荷电性、同血浆蛋白的结合能力以及特定的载体或受体转运系统有关。一般来讲，分子量越小，脂溶性越强，其透过血脑屏障的能力越强。龙胆碱是脂溶性小分子物质，前期研究表明龙胆碱有抗惊厥及脑保护作用，提示龙胆碱透过血脑屏障可能是其发挥药理作用的基础。

目前检测药物通过血脑屏障的方法按实验对象主要分为四大类：动物活体、离体脑组织、体外血脑屏障模型、数学模型。通过综合比较各种方法的优劣与具体实验时的客观条件，笔者考虑采用活体动物为实验模型，分离脑组织后检测脑内龙胆碱含量。首先通过设计的时间点分别取血和脑组织，通过HPLC法确定最佳的采血与取脑时间点，同时取血和脑组织能保证检测的准确性。随后，为消除脑内血管残留的血液中龙胆碱对检测结果的影响，笔者采用同样体积的生理盐水进行心脏灌流，尽可能地冲出脑内的残余血液；为进一步消除冲洗后残留的血液，笔者又通过设定不同的给药剂量，分别在最佳取脑时间点取脑，因脑内残留的血液中龙胆碱含量基本相同。若药物能够通过血脑屏障，随着给药剂量增加，透过血脑屏障的量也会增加，则脑内检测到的含量也会相应的增加，表现为正向曲线；若不能透过血脑屏障，则应为一条直线或近似直线。研究结果表明，龙胆碱能够透过血脑屏障。

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Pharmacokinetic Characteristics and Blood-brain Barrier Transport of Gentianine in Rats

LIU Xue-wei，LIU Tian-yu，LIU Shu-min，TANG Qing
（Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetic characteristics and blood-brain barrier transport of gentianine in rats by HPLC.METHODS：Rats were treated by caudal vein injection of gentianine，then cut the tails，the blood was collected into centrifuge tube.Serum was separated by centrifugation and SPE method was used to deposit proteins.The separation was performed on Diamonsil-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（gradient elution）.We performed a whole wavelength scanning at flow rate of 1.0mL·min-1.Then those rats were treated with gentianine intraperitoneally and decapitated.The concentration of gentianine was determined by HPLC.Whether gentianine delivered through blood-brain barrier was evaluated according to the dose of gentianine and the content of it in cerebral tissue.RESULTS:The linear regression equation of gentianine wasA＝2.445×10-7c－44388.6（r＝0.9997，n＝6）.The linear range of gentianine was 3.125×10-4～0.1mg·mL-1，and the lowest detection limit of gentianine was 0.02μg·mL-1.Main pharmacokinetics parameters of gentianine weret1/2α＝8.62min，t1/2β＝116.64min，AUC＝3.57mg·min·mL-1，CL（s）＝28.05mg2·kg-1·mL-1·min-1；Gentianine could be determined in cerebral tissue of rats，and the content of it in cerebral tissue increased as long as the dose of gentianine increased.CONCLUSION:The pharmacokinetic procedure of gentianine with intravenous administration could be described as open two-compartment model;gentianine can deliver across the blood-brain barrier.

Gentianine；Pharmacokinetics；HPLC；BBB

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1734-04

Δ国家教育部科技重点项目（207029）

＊助理研究员，硕士。研究方向：中药药理学与神经科学。电话：0451-82196274。E-mail：liuxuewei2001@163.com

#通讯作者：教授，博士研究生导师。研究方向：中药药效物质基础。电话：0451-82196163。E-mail：lsm@hljucm.net

book=1737,ebook=361

2010-09-12

2010-12-19）