口蹄疫病毒非结构蛋白3Dpol的研究进展＊

孙静静，邵军军，常惠芸

口蹄疫（foot－and－mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot－and－mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMD是OIE规定的A类动物疫病之一，严重影响畜牧业的发展，对世界公共卫生存在着巨大影响，造成巨大的经济损失，素有“政治经济病”之称。FMD的致病原是小RNA病毒科，口蹄疫病毒属成员，于1897年首次确定。FMDV是正链RNA分子，长约8 500bp，包裹于由60个拷贝的4种病毒结构蛋白VP1－4构成的二十面体的衣壳中。FMDV不仅宿主广泛，传播速度快，变异性强，而且血清型多，有7个血清型O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3和70多个亚型，且各血清型间无交叉免疫，同一血清型内的不同亚型或分离株发生交叉免疫的程度均不相同，这种特性给口蹄疫的诊断和疫苗免疫带来极大的困难。

FMDV的3Dpol蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），没有型特异性，在FMDV所有非结构蛋白中，3Dpol抗原性最好，ELISA检测方法的特异性、准确性和敏感性与检测结构蛋白的ELISA方法相当的，是区分是否接触过FMDV动物的重要指标。FMDV的复制也是由病毒编码的聚合酶3Dpol催化，但3Dpol蛋白酶的保真性很差，导致病毒复制的错误倾向率很高，每个核苷酸复制的错误配对率为10－3～10－5，这种低的复制保真性导致了后代快速突变，因此口蹄疫的防控比较困难。3Dpol是非结构蛋白，只是在病毒的复制过程中出现，病毒粒子成熟后仅仅有非常少量的3Dpol。本文综述了口蹄疫病毒基因组结构及3D基因，3Dpol蛋白的表位、结构、功能的国内外最新研究进展。

1 FMDV基因组结构

FMDV基因组为单股正链RNA，既是mRNA，又是负链RNA的模板，约有8 500个核苷酸（nts）组成，基因组的基本结构是：VPg－5′UTR（S－polyCIRES）－（L 蛋 白 ）－结 构 蛋 白 P1（VP4－VP2－VP3－VP1）－非 结 构 蛋 白 （2A－2B－2C－3A－3B－3B－3B－3C－3D）－3′UTR－poly（A）。

VPg在病毒RNA开始复制时起重要作用，同时参与病毒装配，只有病毒RNA与VPg结合后，才能够被装入病毒。5′－UTR约含1 300个碱基。S片段由360个碱基组成，可形成一个长茎环结构（stem－loop）。S片断下游是约400bp的 Poly（C）序列。Poly（C）片段几乎全部由胞嘧啶组成，约占90%，仅有少量的U与A。IRES长约1 350bp，控制不依赖于帽子结构的FMDV RNA的翻译起始。下游3′－UTR序列可自身折叠成茎环结构，对病毒基因组的复制有重要作用，复制过程中3′－UTR可以结合病毒复制相关蛋白。3′－UTR下游是长度不一的poly（A）结构，Poly（A）尾与病毒的感染性有关，Poly（A）越长感染性越强。基因组的中部是一大的开放阅读框（ORF），编码一多聚蛋白。基因组的ORF分为4个区域，分别为L区、P1区、P2区、P3区。多聚蛋白的裂解过程是由三种蛋白酶：Lpro，2A和3C来完成的，多聚蛋白经3级裂解后，形成3～4种病毒结构蛋白（VP0或 VP4、VP2，VP3，VP1）和8～9种非结构蛋白（Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。ORF的5′末端为 L区，长约600bp，主要编码N末端多聚蛋白Lab和Lb，两种蛋白作为酶能在L／P1连接处进行自我切割释放。L区的下游为P1区，P1区全长约2 200bp，编码FMDV的4种结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1，分别由85、218、220个和213个氨基酸组成。P1区的下游为P2区，约1 460bp，编码2A、2B和2C3种非结构蛋白，分别由16、154和318个氨基酸组成。P2区的下游为P3区，长约2 720bp，编码约908个氨基酸的聚合蛋白，该聚合蛋白含有3A、3个3B、3C和3Dpol6种多肽。

2 3Dpol抗原表位的研究

FMDV的免疫保护与中和抗体水平和亲和力有关，研究发现针对B细胞表位的合成肽免疫原性低，不能产生持久的保护水平的中和抗体。Collen等［2］的研究认为机体抗口蹄疫病毒是一种依赖T细胞的体液免疫应答反应，抗体的产生需要T细胞参与。迄今为止，除了在结构蛋白区发现部分T细胞表位外，越来越多的研究显示，T细胞表位主要分布在FMDV非结构蛋白（3ABC和3Dpol）上。国内外有关3Dpol蛋白T细胞表位的研究主要有：Collen［3］等在研究FMDV相关T细胞表位时发现，FMDV的非结构蛋白3Dpol具有刺激病毒感染牛外周血淋巴细胞增殖的能力，由此推测3Dpol上存在潜在的T淋巴细胞表位。Blanco等［4］发现，T细胞辅助表位区与B细胞表位区的串联可以协助B细胞产生特异性抗体，提高优势抗原表位区的免疫原性。García－Briones等［5］用 表 达 FMDV 非 结 构 蛋 白3Dpol的痘苗病毒免疫猪，即使在猪体内检测不到中和抗体的情况下也能得到部分保护，这些猪在受到FMDV攻击时出现典型临床症状缓慢，结果与上述Collen等的推测基本一致。另外利用针对3Dpol氨基酸序列人工化学合成的重叠肽段对FMDV感染猪的外周血淋巴细胞进行刺激，结果发现很多肽段都能够有效刺激淋巴细胞增殖，而且这些淋巴细胞能够大量分泌IFN－γ等Th1类细胞因子。这一方面在一定程度上解释了3Dpol蛋白能够在无中和抗体条件下给动物提供部分保护的现象；另一方面也使人们进一步了解到3Dpol蛋白用于新型疫苗研究的潜在价值。WilhelmGerner等［6］在c／c和d／d单体型微型猪内发现了口蹄疫3Dpol非结构蛋白上被SLA识别的特异的T细胞表位，位于346－370位氨基酸，这为口蹄疫新型疫苗的设计提供了有用的信息。不同种属宿主和不同个体的T细胞对T细胞表位的识别是受到机体MHC分子多态性的限制的，3Dpol蛋白作为不同血清型及不同毒株之间相对保守的功能蛋白，极可能存在保守的病毒T细胞表位，能够被不同的宿主及个体T细胞所识别。

图1 口蹄疫病毒基因组结构和成熟蛋白［1］Fig．1 FMDV genome structure and matured protein［1］

3 3Dpol的表达时相及结构

3Dpol蛋白在病毒复制的早期产生。García－Briones等［7］研究了 FMDV 在 BHK－21细胞中的分布，免疫荧光试验发现在感染后1．5h首先检测到非结构蛋白3Dpol，之后2～2．5h才检测到其他的非结构蛋白2B、2C、3B、3C，他们均以间歇分散的模式出现，3A和3Dpol集中在核的一侧。经共聚焦显微镜发现，虽然3Dpol短暂表达，但其在细胞核包括核仁中分布均匀，这与转染3AB的细胞一致。在感染细胞中还发现3Dpol和其前体3CD，表明在FMDV感染时，这些蛋白可以同细胞核直接作用。

FMDV 3Dpol约有470个氨基酸残基，形成典型的右手结构，与其它的聚合酶的三维结构一样，有典型的手指、手掌和拇指亚结构。在 NH2末端（1－96位氨基酸）连接手指和拇指结构亚域的片段包围着酶的活性位点，这个区域又称为指套，与其他属病毒的聚合酶相比，这是FMDV 3Dpol特有的。手指和手掌亚结构域包含6个不同的模体：A、B、C、D、E和F。手指亚结构域（97－207位和249－302位）包含8个α螺旋 （α3－α9）和7个β折叠 （β3－β7和β9－β10）；手掌亚结构域 （230－248位和303－403位）包含2个螺旋（α11，α12），5个β折叠片（β8，β11，β12，β14，β15），有3个β折叠片（β8，β11，β12）位于α11 和α12之间，这段区域是所有聚合酶中最保守的区域［8］，由5个保守模体A－E组成，在核苷酸结合、磷酰基转移、手掌亚结构域的完整性和引导核苷酸结合方面发挥重要作用。拇指亚结构域（403－470位）包含4个α螺旋 （α13－α16）和2个卷曲［9］。

4 3Dpol的功能

FMDV 3Dpol首先以基因组正链为模板合成互补的负链RNA，然后再以负链为模板合成子代病毒的基因组的正链RNA。研究表明正链RNA病毒的复制有2种方式：引物依赖的RNA合成和引物非依赖的RNA合成即从头合成。FMDV RNA合成是以VPg为引物的引物依赖的合成方式。之前研究已经阐明了PV、FMDV和HRVs的RdRps的三维结晶结构，要么是非结合蛋白，要么是形成引物－模板－NTP底物复合物［11－12］。正链和负链 RNA合成的第一步是形成VPg－pU（带有一个UMP的VPg同酪氨酸Tyr3共价结合），之后发生尿苷化，紧接着进行引物延伸。CV－B3RdRp采用了一个典型的RdRp折叠方式，与其它聚合酶一样，RdRp亚结构域中最保守的是起催化作用的拇指结构域，2个天冬氨酸和2个二价的金属离子都是催化作用必须的［13］。FMDV 3Dpol与 VPg结合位点和 CV－B3 RdRp与VPg结合位点不同，在FMDV 3Dpol与VPg残 基 1－GPYAGPLERQPRPLKV－15 结 合，但 是CVB3 3Dpol－VPg 复 杂 结 构 表 明，VPg 7－PNQKPRVPT－15位残基与3Dpol拇指结构域的底部结合。其实早在研究PV RdRp时，通过一系列的遗传学和生物学实验已经证明了第2个结合位点的存在，并且通过结构验证了其准确性［14－15］。3Dpol催化的FMDV RNA复制机制如下：

图2 FMDV 3Dpol－RNA－RTP结晶结构［10］A：3Dpol与引物模板结合；B：3Dpol骨干；C：不同FMDV的3Dpol结构重叠Fig．2 FMDV 3Dpolcrystal structureA：3Dpol－template－pmimer molecular；B：3Dpol bone，C：superimposition of different FMDV 3Dpol

4．1 FMDV引物依赖性的复制起始 在RNA复制的起始，RdRp与病毒和宿主的许多蛋白相互作用。在小RNA病毒科中，3DPol使病毒编码的引物蛋白VPg尿苷化，从而引发复制的起始［16］。3DPol和VPg 2个复合物的结构及其定点突变的效应分析，揭示了位于3DpolPol活性位点的残基不仅参与与VPg结合，而且与RNA合成起始的VPg尿苷化反应密切相关［17］。

VPg采用几乎不具二级结构的完全伸展的构相，结合在3DPol聚合酶的中心槽，VPg的N末端部分位于NTP通道附近，使突出的第3位Tyr残基的侧链深入活性位点区域，之后VPg滑行穿过大的RNA结合位点到达拇指结构域［18］。手指、手掌、拇指结构域的保守残基对于VPg的结合稳定性有重要作用。在3DPol－VPg－UMP复合物中，Tyr3侧链的－OH与UMP分子的α－磷酸共价结合，模体F带正电的残基参与尿苷化反应，使Tyr3和UMP稳定在一个合适的构象。模体A和C的天冬氨酸（Asp）及2个二价的阳离子也参与尿苷化反应，其机制与其它聚合酶催化的核苷酸酸转移反应相似［19］。已有研究表明，在RNA复制起始和延伸过程中3Dpol聚合酶的结构不同。依据FMDV VPg的结构，复制起始时FMDV 3DPol模体B的保守残基的307位天冬酰胺与尿苷化复合物的3′－OH作用，但 在 延 伸 过 程 中 是 2′－OH［20］。 氟 尿 苷 三 磷 酸（FUTP）是 VPg尿苷化的抑制剂，但不能抑制延伸。

PV蛋白酶和聚合酶前导蛋白3CD的结晶结构也完全支持FMDV的尿苷化模型，在3CD分子与VPg结合位点之间存在有大量接触面，同样FMDV 3Dpol－VPg复合物中3Dpol与VPg所形成的接触界面，在病毒复制起始促进和调节VPg尿苷酰化方面发挥重要作用［21］。

4．2 FMDV 3DPol引发的引物模板识别和链的延伸 有序的核苷酸转移反应是RNA延伸的基础。核苷酸转移反应是引物链的3′－OH亲核进攻核苷三磷酸的α－磷酸，从而形成磷酸二酯键，释放PPi。根据两个金属离子催化模型，金属离子A会降低引物3′－OH的pKa，从而引发去质子化；金属离子B确定进入的核苷酸的方向，在PPi从聚合酶上释放之前将其质子化［22］。但最近的另一项研究表明，不同的聚合酶催化的核苷酸延伸过程中的突变分析和动力学分析，PPi的质子供体是位于酶活性位点的带正电的氨基酸残基［23］。

正链RNA病毒的聚合酶的保守氨基酸残基位于结合槽内，是同核苷酸底物相互作用的优势候选物，如模体A和C上的两个天冬氨酸（第245位Asp和第338位Asp），还包模体B上的保守残基第303位 Thr，第304位Ser和第307位 Asn［24］。在自然底物ATP和UTP存在时，或有诱变剂如FUTP和利巴韦林三磷酸（RTP）存在时，得到4种FMDV 3DPol的催化反应复合物，由此发现RNA延伸过程可以分为4步［25］：第1步，3DPol－RNA－RTP复合物表明抗病毒诱变剂占据聚合酶的活性位点，与发生磷酰基转移反应的位点相同；第2步，3DPol－RNA－ATP复合物表明形成新的碱基对，RNA产物易位，PPi释放；第3步，3DPol－RNA－ATP／UTP 复合物表明RNA产物易位，新的底物定位到活性位点附近；第4步，3DPol－RNA－FUTP复合物表明突变核苷酸类似物FUTP与新生RNA结合，释放PPi。4种复合物的比较表明，位于模板和引物核苷酸的结合位置的聚合酶残基，参与识别和定位新的参与延伸反应的核苷酸。

5 结 语

有关FMDV 3Dpol结构和功能的研究有了一定的进展，但仍有许多未知。FMDV 3Dpol是非常保守的非结构蛋白，在病毒的复制和转录过程中发挥重要作用，也是非常有效的抗病毒靶标。现在也发现针对结构蛋白和结构蛋白2C、3A、3C的抑制剂，相信随着科技的发展，一定会发现更多的抗FMDV复合物，从而为有效的控制此严重危害畜牧业发展的传染性疾病做出贡献。

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