硫酸卡那霉素注射液中有关物质测定方法研究

李玉林，陈真文，周 玲，毛先兵，冉隆富

(西南药业股份有限公司，重庆 400038)

硫酸卡那霉素注射液中有关物质测定方法研究

李玉林，陈真文，周 玲，毛先兵，冉隆富

(西南药业股份有限公司，重庆 400038)

目的采用高效液相色谱－蒸发光散射检测器(HPLC－ELSD)法测定硫酸卡那霉素注射液中有关物质。方法采用Zorbax SB－C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以 0.2 mol/L 三氟醋酸溶液 －甲醇(95 ∶5)为流动相，流速为 1.0 mL/min，柱温为室温，用蒸发光散射检测器检测(漂移管温度为80℃，载气压力为1.0 bar)。结果以对照溶液质量浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算回归方程，其相关系数(r)均大于0.999，二者线性关系良好。结论高效液相色谱－蒸发光散射检测器法简便、准确、专属、灵敏。

高效液相色谱－蒸发光散射检测器法;卡那霉素;有关物质;硫酸卡那霉素注射液

硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)是一种氨基苷类抗生素，又名卡那霉素A，主要与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质合成。对于氨基苷类抗生素卡那霉素、阿奇霉素和链霉素等末端紫外吸收的品种[1]，难以选用紫外检测器检测，在第29版《美国药典》中含量测定采用电化学检测器[2]，而电化学检测器在国内尚不普及，在2010年版《中国药典》中上述品种的组分及含量测定采用通用型蒸发光散射检测器[3]。但两国药典仅涉及硫酸卡那霉素注射液的卡那霉素B含量控制，未涉及一般有关物质的检测。为了保证用药安全，有必要建立一种新方法，既可检测卡那霉素B，又能检测一般有关物质。本试验用高效液相色谱－蒸发光散射检测器(HPLC－ELSD)测定硫酸卡那霉素注射液中的有关物质，包括卡那霉素B和一般有关物质。方法学考察表明，该法简便、准确、专属、灵敏，可用于硫酸卡那霉素注射液有关物质的控制。

1 仪器与试药

LC－10AD型高效液相色谱仪(岛津);SEDEX55型蒸发光散射检测器(法国)。硫酸卡那霉素对照品(批号为130556－200501，中国生物制品检定所);硫酸卡那霉素B对照品(批号为130548－200501，中国药品生物制品检定所);硫酸卡那霉素注射液(西南药业股份有限公司，批号为20090301，20090302，20090303，规格为2 mL∶0.5 g，处方包括主药硫酸卡那霉素和辅料亚硫酸氢钠);甲醇(色谱纯)，其他试剂(分析纯)，水(重蒸馏水)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Zorbax SB －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.2 mol/L三氟醋酸溶液 －甲醇(95∶5);流速:1.0 mL/min;柱温:室温;进样量:20 μL;蒸发光散射检测器:漂移管温度80～95℃，载气压力 1.0 bar。

2.2 检测方法

分别称取卡那霉素对照品和卡那霉素B对照品适量，用水溶解并制成每1 mL约含二者各80 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色谱仪，卡那霉素峰与卡那霉素B峰的分离度大于5.0;5次进样卡那霉素和卡那霉素B峰面积的相对标准偏差不超过2.0%。取本品适量，用水溶解并定量稀释成2 g/L的溶液，作为供试品溶液;精密称取卡那霉素对照品适量，用水定量稀释制成10，20，50 μg/mL 的溶液，作为对照溶液 A，B，C。分别精密量取 20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，以对照溶液质量浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算回归方程，相关系数(r)应不小于 0.99。

2.3 方法学考察

流速选择及系统适用性试验:分别称取卡那霉素对照品与卡那霉素B对照品适量，用水溶解并稀释制成每1 mL约含二者各80 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色谱仪，以1.0 mL/min的流速运行，记录色谱图。连续进样5针，有关物质峰与卡那霉素峰的分离度均大于5，卡那霉素的 RSD为1.2%，卡那霉素B的 RSD为1.6%，表明卡那霉素与其有关物质分离良好，系统适用性试验的各项指标符合规定，因此将本品流速定为1.0 mL/min。

耐用性试验:取批号为20090301的样品，分别在流动相比例为含甲醇 2.0%和 8.0%，酸度分别为 2.0和 2.4，流速分别为 0.8和1.2 min/mL的条件下，观察色谱条件对系统适应性的影响。结果表明，色谱条件的微小变动对系统适用性影响不大。

专属性试验:考虑到多种因素可能导致本品主药硫酸卡那霉素降解产生有关物质，故在强光、酸、碱、氧化和高温条件下对样品做破坏试验，使之产生有关物质，以考察本检测方法的有效性;另取硫酸卡那霉素注射液辅料制备空白溶液，同法操作。取样品，依次进行强光破坏(取本品0.4 mL，在4 500 lx±500 lx光照强度下照射12 h)、酸破坏(取本品0.4 mL，加5 mol/L盐酸溶液1 mL，于80℃水浴中放置2 h，随后加5 mol/L氢氧化钠0.4 mL对酸进行中和)、碱破坏(取本品 0.4 mL，加 5 mol/L 氢氧化钠 0.4 mL，于 80 ℃水浴中放置2 h，随后加5 mol/L盐酸溶液0.4 mL对碱进行中和)、高温破坏(取本品0.4 mL，于120℃下放置2 h)、氧化破坏(取本品0.4 mL，加 30%H2O2溶液 0.4 mL，于 80 ℃水浴中放置 2 h)试验。结果见图1。可见，本品在酸、碱破坏条件下，均会产生拟订的色谱条件下能够检测到的降解产物，而高温、氧化和强光没有新的杂质产生，说明本品的光、热、抗氧性良好;各降解产物峰与硫酸卡那霉素峰分离良好，不影响本品有关物质及硫酸卡那霉素含量的测定。另外，样品、辅料和原料经酸、碱破坏后峰5都增大，这是由酸和碱中和后生成NaCl造成的;样品和原料经酸破坏后峰3都增大，说明强酸破坏会生成更多的一般有关物质。

图1 专属性考察图谱

辅料干扰试验:本品中的辅料为亚硫酸钠，在上述色谱条件下，SO32－和 SO42－峰重合。从图 1 也可看出，Na+峰、SO42－峰与主药分离良好，故辅料不影响主药含量的测定。

线性关系考察:精密称取硫酸卡那霉素对照品适量，加水定量稀释制成 9.2，24，48 μg/mL 的溶液，作为对照溶液 A，B，C。再精密量取各对照溶液20 μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积。以对照溶液质量浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算回归方程，相关系数(r)均大于 0.99，表明本品质量浓度在 9.2 ～48 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

检测限和定量限确定:取批号为20090301的样品适量(有关物质的量为1.43%)，分别用水溶解并定量稀释成每1 mL含有关物质 17.875，8.94，4.47 μg 的溶液，各取 20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。由图谱分析可知，有关物质质量浓度为8.94 μg/mL时，其信噪比(S/N)为10;质量浓度为 4.47 μg/mL时，其信噪比(S/N)为 3。故本品有关物质的检测限为 4.47 μg/mL，定量限为8.94 μg/mL。

重复性试验:取批号为20090301的样品适量，用水溶解并定量稀释成2 g/L的溶液，取20 μL注入液相色谱仪，连续6次。结果一般有关物质的 RSD为 1.9(n=6)，卡那霉素 B的 RSD为1.3(n=6)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12 h时测定其有关物质。结果硫酸卡那霉素一般有关物质的 RSD为1.4，卡那霉素B的 RSD为1.8(n=4)，表明供试品溶液在12 h内是稳定的。

2.4 样品测定

分别精密量取3个批号的供试品溶液，测其有关物质含量。结果见表1。

表1 样品中有关物质含量测定结果(%)

3 讨论

温度是影响蒸发光散射检测器灵敏度的重要因素。试验中设置了如下几种不同条件:温度50℃，载气压力1.0 bar;温度80℃，载气压力 1.0 bar;温度 95℃，载气压力 1.0 bar。取 2.2项下的供试品溶液20 μL，在上述设定的条件下进样，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。比较3种条件下的色谱图，卡那霉素B及其他有关物质个数相等;但50℃，80℃，95℃时有关物质信噪比分别为24，42，46，故温度为80℃和95℃的信噪比比较接近且检测灵敏度高，因此检测温度确定为80～95℃。

对于检测用氮气，SEDEX55型蒸发光散射检测器可控制其压力而不能改变其流量，因此对载气压力做了研究。在流速1.0 mL/min和漂移管温度 80℃条件下，比较了 3种载气压力(0.5，1.0，1.5 bar)，结果卡那霉素B和其他有关物质的保留时间基本一致;0.5 bar和 1.0 bar的信噪比一致，1.5 bar的有关物质信噪比比前两者小，因此确定检测压力为1.0 bar。

蒸发光散射检测器是近年来新发展的通用型质量型检测器，由于其响应值不依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的样品特别是不含共轭结构或无特征紫外吸收的物质用它检测均有极大的优越性。近年来已有利用蒸发光散射检测器来分析氨基糖苷类抗生素含量及有关物质的报道[4－5]，2010年版《中国药典(二部)》硫酸卡那霉素注射液项下没有设定有关物质检测项，为确保药品的安全性以及更好地控制产品质量，参考2010年版《中国药典(二部)》硫酸卡那霉素含量测定方法和硫酸妥布霉素有关物质[1]测定方法建立了本品的有关物质检查方法。方法学考察表明，该法简便、准确、专属、灵敏。

[1]陈建琴.蒸发光散射检测器在氨基糖苷类抗生素中的应用进展[J].中国药业，2008，17(14):78 －80.

[2]The United States Pharmacopeial Convention.USP29[M].USA，2005:1 212.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社，2010:967－999.

[4]张建革，刘 英，王立萍.HPLC－ELSD测定硫酸庆大霉素注射液含量及其有关物质的研究[J].华西药学杂志，2010(1):80－82.

[5]戴向东，李慧义，张启明，等.HPLC—ELSD法测定硫酸新霉素的含量及有关物质新霉胺[J].药物分析杂志，2007，27(2):212－215.

Determination of Related Substances in Kanamycin Sulfate Injection by HPLC－ELSD

Li Yulin，Chen Zhenwen，Zhou Ling，Mao Xianbing，Ran Longfu
(Southwest Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chongqing， China 400038)

ObjectiveTo establish a HPLC－ELSD method for the determination of the related substances in Kanamycin Sulfate Injection.Methods The HPLC system consisted of the C18chromatographic column(250 mm × 4.6 mm，5 μm)and the mixture of 0.2 mol/L trifluoroacetic acetic acid － methanol(95 ∶5)as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was the room temperature.The evaporative light scattering detector(ELSD)with the drift tube temperature of 80 ℃ and carrier gas pressure of 1.0 bar was adopted for detection.Results The regression equation was calculated by the logarithm values of reference solution concentration and the corresponding peak area，the correlation coefficients(r)all were greater than 0.999，showing the good linear relationship between them.Conclusion This method is simple and accurate with good specificity and high sensitivity.

HPLC－ELSD;kanamycin;related substances;kanamycin sulfate injection

R927.11;R978.1+2

A

1006－4931(2011)10－0041－03

李玉林(1974－)，女，医学硕士，执业药师，主管药师，主要从事药物制剂研究，(电话)023－89855237(电子信箱)li_y_l@163.com。

2010－09－06)