芘荧光探针法结合曲线拟合研究胆盐－磷脂混合纳米胶束的聚集行为

陆国庆 ，郑 江 ，郑新川 ，鲁永玲 ，何凤慈

(1.中国人民解放军第三军医大学科研部，重庆 400038; 2.中国人民解放军成都军区总医院临床药学科，四川 成都 610083; 3.中国人民解放军第三军医大学西南医院中心实验室，重庆 400038)

芘荧光探针法结合曲线拟合研究胆盐－磷脂混合纳米胶束的聚集行为

陆国庆1，2，郑 江3，郑新川3，鲁永玲3，何凤慈1

(1.中国人民解放军第三军医大学科研部，重庆 400038; 2.中国人民解放军成都军区总医院临床药学科，四川 成都 610083; 3.中国人民解放军第三军医大学西南医院中心实验室，重庆 400038)

目的研究不同磷脂比例的胆盐－磷脂混合纳米胶束的聚集行为。方法以芘为荧光探针，测定不同磷脂比例的胆盐－磷脂混合纳米胶束增溶芘后的荧光光谱，以 I1/I3值(I1=372 nm，I3=383 nm)为纵坐标、胶束浓度对数值logC为横坐标，利用Origin8.0软件进行曲线拟合，以S型曲线的突变中点切线和平行切线的交点定义临界胶束浓度。结果磷脂/胆盐比例(W/W)为2∶1，1∶1，1∶2的混合胶束临界胶束浓度分别为0.034，0.048，0.055 g/L。结论提高混合胶束中磷脂比例，可以减小胶束的临界胶束浓度，有利于胶束发挥更大的增溶作用。

芘;荧光探针;胆盐;磷脂;临界胶束浓度

胆盐－磷脂混合纳米胶束(bile salt－phosphatidylcholine mixed nano－micelle，BS/PC－MM)是指在溶液中由溶质分子(胆盐、磷脂)通过缔合方式形成的，以疏水基团为内核、亲水基团为外壳的分子有序聚集体，粒径通常在10～100 nm范围内。两亲性溶质分子在溶液中分散达到临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)时，分子即缔合自组装形成胶束。利用胶束对难溶性药物进行包裹，可显著提高药物溶解能力，还可增强药物疗效，减少辅料对机体的不良反应，这是一种生物相容性药物传递系统。国外学者已成功地将其应用于地西泮类药物的增溶[1－3]。临界胶束浓度可作为BS/PC－MM的一种度量，其值越小，表明形成胶束所需的浓度越低，越有利于形成胶束，越有利于对难溶性药物的增溶。另外，临床应用时药物进入人体后，胶束制剂都会被液体进一步稀释，稀释到一定程度时胶束将解缔合，影响药物形态的保持及其在体内的释放方式。因此研究不同种类胶束的聚集行为，具有重要意义。芘荧光探针法操作简单，对研究体系的干扰小，是一种研究胶束聚集行为的常规方法。芘荧光光谱中的 I1(372 nm)与 I3(383 nm)的比值I1/I3，强烈地依赖于芘本身所处体系的极性，可以利用 I1/I3值的变化来表征体系的极性变化，即利用 I1/I3对胶束浓度的对数值作曲线图，找出其中 I1/I3变化的拐点，即为临界胶束浓度[4－10]。本研究采用芘荧光探针法结合Origin曲线拟合，研究不同磷脂比例混合纳米胶束临界胶束浓度的差异，讨论了不同磷脂比例对胶束聚集行为的影响，以期为构建增溶能力强、稳定性好的BS/PC－MM提供有益的参考。

1 仪器与试药

F 2500型荧光分光光度计(日本日立公司);旋转蒸发仪(瑞士Büchi公司):V－800型蒸发器，V－500型真空装置，B－490型水浴装置，B－740型冷凝器;艾科普ACD－6000－U型高端超纯水系统;5417R型低温高速离心机(Eppendorf);电子天平(Sartorius，BS223S，max 220 g，d=0.001 g;Sartorius BP61S，max 61 g，d=0.1 mg);KQ －50B型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。冬凌草甲素(oridonin，ORI，纯度大于98.07%，西安旭煌生物科技有限公司，批号为 081216);大豆磷脂(soya phosphatidylcholine，SPC，纯度大于90%，上海太伟药业有限公司，批号为20080320);脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate，SDC，纯度大于90%，北京奥博星生物技术责任有限公司，批号为20090114);芘(纯度99.0%，Sigma公司);水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 芘储备液配置

精密称量芘37.9mg，以10mL丙酮溶解，超声至澄清，取0.5mL，置10 mL容量瓶中，丙酮定容，取0.4 mL，置10 mL容量瓶，丙酮定容，分别吸取0.1 mL，置10 mL容量瓶中，挥干丙酮，加入10 mL胶束溶液，即可得浓度为4×10－7mol/L的芘储备液。

2.2 混合胶束制备

精密称量处方量大豆磷脂、脱氧胆酸钠(固定总浓度，大豆磷脂与脱氧胆酸盐之比为2∶1，1∶1，1∶2)，制备混合胶束，分别加入各容量瓶中，最后加入超纯水定容，使胶束溶液质量浓度分别为1 ×10－4，3 × 10－4，6 × 10－4，1 × 10－3，2 ×10－3，6 ×10－3，1 × 10－2，3 ×10－2，6 ×10－2，1 × 10－1，3 ×10－1g/L。

2.3 荧光发射光谱测定

将胶束溶液加至各容量瓶中(使芘溶液浓度为4×10－7mol/L)，超声30 min，室温放置24 h，测定各稀释液的荧光发射光谱，计算 I1/I3值。

激发光波长确认[4－5]:使芘溶液浓度为4×10－7mol/L，固定发射波长350 nm，Ex狭缝为5 nm，Em狭缝为2.5 nm，激发电压700 mV，扫描速度300 nm/min，激发波长扫描范围220～500 nm。确认激发波长为336 nm，与文献[4－5]报道的一致。见图1。

荧光光谱突变点 I1及 I3确认[4－5]:使芘溶液浓度为4×10－7mol/L，胶束溶液质量浓度分别为 1 ×10－4，3 ×10－4，6 ×10－4，1 ×10－3，2×10－3，6 ×10－3，1 ×10－2，3 ×10－2，6 ×10－2，0.1，0.3 g/L。激发波长为336 nm，Ex狭缝为5 nm，Em狭缝为2.5 nm，激发电压为700 mV，扫描速度为300 nm/min，发射波长扫描范围 350～450 nm。结果芘荧光发射光谱共5个突变点，其中 I1(372nm)及 I3(383 nm)是试验所需要的突变点。见图2。

2.4 不同磷脂比例混合胶束芘荧光探针光谱的I1/I3计算

按照大豆磷脂与脱氧胆酸盐之比(SPC/SDC)为 2 ∶1，1 ∶1，1 ∶2(W/W)，分别计算在不同浓度组的 I1/I3值。结果见表1。

图1 芘荧光激发波长确认

图2 不同浓度混合胶束溶液中芘的荧光发射光谱

表1 不同磷脂比例、不同浓度混合胶束中的芘荧光探针光谱的 I1/I3值(n=3，±s)

表1 不同磷脂比例、不同浓度混合胶束中的芘荧光探针光谱的 I1/I3值(n=3，±s)

C(g/L) log C SPC/SDC=1 ∶2 SPC/SDC=1∶1 SPC/SDC=2∶1 123123123 0.000 1 0.000 3 0.000 6 0.001 0.002 0.006 0.01 0.03 0.06 0.1 0.3 0.6 1－4.00－3.52－3.22－3.00－2.70－2.22－2.00－1.52－1.22－1.00－0.52－0.22 0.00 1.785 1.789 1.760 1.762 1.700 1.629 1.482 1.289 1.197 1.194 1.193 1.168 1.161 1.781 1.770 1.776 1.760 1.721 1.614 1.511 1.266 1.217 1.218 1.167 1.152 1.144 1.779 1.769 1.762 1.749 1.737 1.621 1.523 1.351 1.234 1.214 1.160 1.153 1.144 Mean 1.781 1.776 1.766 1.757 1.719 1.621 1.505 1.302 1.216 1.209 1.173 1.158 1.149 SD 0.002 0.009 0.007 0.006 0.015 0.006 0.017 0.036 0.015 0.011 0.014 0.007 0.008 1.750 1.742 1.745 1.704 1.706 1.612 1.496 1.272 1.193 1.152 1.145 1.145 1.147 1.752 1.748 1.742 1.703 1.713 1.590 1.495 1.259 1.197 1.148 1.142 1.144 1.142 1.757 1.754 1.725 1.700 1.678 1.573 1.479 1.267 1.198 1.158 1.141 1.151 1.143 Mean 1.753 1.748 1.737 1.702 1.699 1.591 1.490 1.266 1.196 1.152 1.143 1.147 1.144 SD 0.003 0.005 0.009 0.001 0.015 0.016 0.008 0.006 0.002 0.004 0.002 0.003 0.002 1.768 1.739 1.746 1.736 1.716 1.559 1.429 1.243 1.178 1.157 1.162 1.155 1.159 1.769 1.749 1.748 1.718 1.686 1.552 1.432 1.257 1.185 1.156 1.155 1.153 1.158 1.768 1.759 1.748 1.732 1.696 1.548 1.410 1.238 1.178 1.158 1.161 1.156 1.151 Mean 1.768 1.749 1.747 1.728 1.699 1.553 1.424 1.246 1.180 1.157 1.159 1.155 1.156 SD 0.000 0.008 0.001 0.008 0.012 0.005 0.010 0.008 0.003 0.001 0.003 0.001 0.004

2.5 曲线拟合

以芘的荧光光谱强度 I1/I3为纵坐标、混合胶束溶液浓度对数值logC为横坐标，采用Origin8.0软件拟合曲线。因曲线变化趋势符合Boltzmann 公式[4－10]:I1/I3=A2+(A1－ A2)/{1+exp[(X － x0)/dx]}，其中 A1是低浓度下的 I1/I3，A2是高浓度下的 I1/I3，X0是曲线突变的中点。结果采用Origin8.0软件进行曲线拟合，得到突变中点 X0，经与Matlab软件对数据二次求导所获拐点，数据一致。见图3。

图3 不同磷脂比例、不同浓度混合胶束中芘荧光探针光谱的I1/I3与浓度对数值的曲线拟合

2.6 临界胶束浓度确定

因胆盐和磷脂属于低相对分子质量表面活性剂，结合文献[5]方法，不能单纯依靠 X0值对临界胶束浓度进行判断，否则容易产生误差。故需要在确定突变中点的情况下，绘制曲线切线，通过倾斜部分与水平部分的切线交点，确定胶束的临界胶束浓度。根据切线交点的横坐标值进行对数求值，可得不同大豆磷脂与脱氧胆酸盐之比(SPC/SDC)的混合胶束的临界胶束浓度。结果见图4及表2。可见，提高混合胶束中磷脂比例，可以减小混合胶束的临界胶束浓度。

表2 不同磷脂比例混合胶束的临界胶束浓度

图4 不同磷脂比例混合胶束的临界胶束浓度(SPC/SDC=1∶2(W/W))

3 讨论

本研究依靠芘荧光探针法结合Origin软件拟合曲线，研究了不同类型胶束的聚集行为。发现提高磷脂的含量，可以显著降低混合胶束的临界胶束浓度。这可能与加入磷脂后降低了分子间斥力、增加聚合作用[11]，从而使得胶束更容易形成有关。另外，磷脂本身的辅助治疗作用，也提示应在保证一定溶解度的情况下，适当提高药物传递系统中的磷脂含量。

[1]Hammad MA，Müller BW.Increasing drug solubility by means of bile saltphosphatidylcholine－based mixed micelles[J].Eur J Pharm Biopharm，1998，46(3):361 － 367.

[2]Hammad MA，Müller BW.Solubility and stability of tetrazepam in mixed micelles[J].Eur J Pharm Sci，1998，7:49 － 55.

[3]Hammad MA，Müller BW.Solubility and stability of clonazepam in mixed micelles[J].Int J Pharm，1998，169:55 －64.

[4]严 峰，曹绪龙，李振泉，等.荧光法测定N－(α－烷苯氧基)十四酰基牛磺酸钠的临界胶束浓度[J].感光科学与光化学，2007(25):115－122.

[5]J.Aguiar PC，Ruiz JA，Ma CC.On the determination of the critical micelle concentration by the pyrene 1:3 ratio method[J].Journal of Colloid and Interface Science，2003，258:116 －122.

[6]Yan M，Li B，Zhao X.Determination of critical aggregation concentration and aggregation number of acid－soluble collagen from walleye pollock(Theragra chalcogramma)skin using the fluorescence probe pyrene[J].Food Chemistry，2010，122(4):1 333－1 337.

[7]Xue Zhen，Ren GL，Xu HW，et al.Study of betaine solutions by fluorescent probes of pyrene and pyrene－3－carboxaldehyde[J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects，1995，100:165 － 172.

[8]Quagliotto P，Barbero N，Barolo C，et al.Characterization of monomeric and geminicationic amphiphilic moleculesby fluorescenceintensityand anisotropy[J].Dyes and Pigments，2009，82(2):124 －129.

[9]Mravec F，Halasová T，Pekar M，et al.Fluorescence study of polysaccharide in dilute aqueous solution[J].Chemicke Listy，2008，102(15):1 096 －1 098.

[10]Seguin C，Eastoe J，Heenan R K，et al.Controlling aggregation of nonionic surfactants using mixed glycol media[J].Langmuir，2007，23(8):4 199 －4 202.

[11]梁惠君，陈建明，宋 华，等.应用混合胶束制备紫杉醇注射液[J].中国医药工业杂志，2008，39(4):258－260.

The Study of Aggregation Behavior of Bile Salt－phosphatidylcholine Mixed Nano－micelle by Pyrene Fluorescence Probe Spectrometry Methods and Curve Fitting

Lu Guoqing1，2，Zheng Jiang3，Zheng Xinchuan3，Lu Yonglin3，He Fengci1
(1.Division of Scientific Research Affairs，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China;
2.Department of Clinical pharmacy，Chengdu Miilitary General Hospital，Chengdu 610083，China;
3.Medical Research Center， Southwestern Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400038， China)

ObjectiveThe aim of current study was to study the aggregation behavior of bile salt－phosphatidylcholine mixed nano－micelle prepared by different phospholipid fraction.MethodsThe fluorescence spectra of different phospholipid fraction of bile salt－ phosphatidylcholine mixed nano－micelle were measured，in which pyrene was solubilized and used as fluorescence probe.I1/I3(I1=372 nm，I3=383 nm)，according to the curves of fluorescence spectra，was taken as Y －axis and logC as X －axis simultaneously.The plot of pyrene versus bile salt－phosphatidylcholine mixed nano－micelle was S－Curve drawn by Origin softwear 8.0 through curve fitting.The intersection point of two tangents to curve was considered as critical micelle concentration.ResultsThe critical micelle concentration of bile salt－ phosphatidylcholine mixed nano－micelle with different phospholipids fraction(2 ∶1，1 ∶1，1 ∶2)were respectively 0.034，0.048，0.055 g/L.ConclusionThe results indicated that increasing phospholipid fraction had lower critical micelle concentration and better solubilization.

pyrene;fluorescence probe;bile salt;phospholipid;critical micelle concentration

R944.9

A

1006－4931(2011)10－0021－03

何凤慈，男，教授，本文通信作者，(电子信箱)furan19@126.com。

2010－06－02)