大肠癌细胞对化疗药物的体外敏感性研究

华 彬 ，魏润新 ，马 莹 ，乔 婧

(1.江苏省泰州市人民医院，江苏 泰州 225300; 2.南通医学院，江苏 南通 226021)

大肠癌细胞对化疗药物的体外敏感性研究

华 彬1，魏润新1，马 莹1，乔 婧2

(1.江苏省泰州市人民医院，江苏 泰州 225300; 2.南通医学院，江苏 南通 226021)

目的利用噻唑蓝(MTT)比色法探讨大肠癌细胞对肿瘤化疗药物的体外敏感性。方法对36例患者的大肠癌组织进行体外培养，利用MTT法测定6种临床常用化疗药物的抑制率。结果36例大肠癌试验中，化疗药物的敏感性从高到低依次为丝裂霉素(MMC)、顺铂(DDP)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、依托泊苷(VP－16)、奥沙利铂(L－OHB)、阿霉素(ADM)。其中18例结肠癌试验中，化疗药物的敏感性从高到低依次为 MMC，DDP，5－FU，VP－16，L－OHB，ADM;18例直肠癌试验中，化疗药物的敏感性从高到低依次为 MMC，DDP，5－FU，L－OHB，VP－16，ADM。结论对于大肠癌，MMC，DDP，5－FU的敏感性较高，可作为首选药物;对于结肠癌和直肠癌，也有相似的规律性。

噻唑蓝比色法;大肠癌;化学治疗;药物敏感性

大肠癌(包括直肠癌和结肠癌)在我国的发病率逐年上升，危害严重。对大肠癌要尽可能采取手术切除，术后有效的化疗有助于提高总体疗效[1]。研究表明，铂类、蒽环类、氟尿嘧啶类、丝裂霉素的疗效较为突出[2]。化疗前对肿瘤患者进行药物敏感性检测，预测化疗药物是否敏感，既能提高化疗效果，又能减少非敏感性化疗药物带来的毒性反应。噻唑蓝(MTT)比色分析法是用于检测细胞活性的一种方法，操作简便、快捷，仅需3 d就能获得满意结果，能充分反映各种化疗药物对肿瘤细胞的杀伤或抑制增殖作用，因而改变了靠临床经验选择化疗药物及化疗方案的传统治疗模式，使肿瘤的化学治疗有的放矢，减少盲目性和耐药性的发生，具有极其重要的临床意义。

1 材料和方法

1.1 药物和材料

丝裂霉素注射液(MMC，批号为100109)、阿霉素注射液(ADM，批号为081003A，为浙江海正药业股份有限公司产品)、顺铂注射液(DDP，齐鲁制药有限公司，批号为9010032DB);5－氟尿嘧啶(5－FU，上海旭东海普药业有限公司，批号为100111);依托泊苷注射液(VP－16，批号为10030613)、奥沙利铂注射液(L－DHB，为江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号为09123012)均以无菌生理盐水稀释，MMC 稀释至 100 μg/mL，DDP稀释至 1 g/L，5－FU 稀释至 1 mg/mL，VP－16稀释至 1 g/L，L－OHB 稀释至142 μg/mL，ADM稀释至100 μg/mL，置－20℃冰箱中保存。完全RPMI－1640培养基，购自美国Gibco公司，含10%小牛血清、青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL;MTT购自美国Sigma公司，使用前用灭菌生理盐水配成5 g/L的工作液。大肠癌组织取自本院手术新鲜标本，在无菌条件下送到实验室。

1.2 方法

1.2.1 大肠癌细胞制备

取切除的大肠癌肿瘤组织，在无菌条件下切取约1 cm3，放入无菌生理盐水中，快速送到实验室。在超净工作台上，用D－Hanks液清洗，用营养液浸泡3 min，去除脂肪、纤维及坏死和血污组织，将剩下的组织用生理盐水洗净，在加有少许RPMI－1640营养液的培养皿中剪碎，置200目不锈钢网筛中过滤，用10 mL注射器芯管研磨，不断加RPMI－1640营养液冲洗，收集滤液，离心(2 000 r/min)处理10 min，去除上层清液，将沉淀物冲洗两次，加RPMI－1640营养液搅匀，形成细胞悬液。

1.2.2 药物敏感性试验

将细胞悬液转移至96孔培养板中，设空白组、试验组、对照组。空白组用营养液和化疗药物;试验组用肿瘤细胞悬液和化疗药液，每药4个孔;对照组用肿瘤细胞和营养液，不加化疗药物。将96孔板置二氧化碳培养箱中培养48 h。取出后每孔加5 g/L的MTT 20 μL，继续培养 4 h，每孔加 100 μL 的溶解液继续培养 16 h，然后将培养板放入酶联免疫检测仪，测定吸光度(A)值(OD570)。

1.2.3 结果判断方法

抑制率(IR)=[1－(肿瘤细胞对照组－空白对照组)/(加药肿瘤细胞组－空白对照组)]×100%。抑制率大于30%为敏感，不超过 30%为不敏感。抑制率比较采用单因素方差分析(oneway ANOVE)，统计化疗药物对癌细胞的抑制率并比较，用SPSS17.0软件，P＜0.05为差异有显著性。药物敏感率=试验中IR＞30%的病例数/试验总病例数×100%。

2 结果

2.1 大肠癌细胞对化疗药物的敏感性

结果见表1，平均抑制率由大到小的化疗药物依次是MMC，DDP，5－FU，VP－16，L－OHB 和 ADM。用 SPSS17.0统计软件包进行数据处理，单因素方差分析 P=0.000，表明6种化疗药物对大肠癌细胞的平均抑制率有显著性差异。经LSD分析，各化疗药物之间比较的 P值见表2。

表1 化疗药物对肿瘤细胞的体外平均抑制率(%)

可见，MMC对大肠癌细胞的体外平均抑制率明显高于5－FU，VP－16，L－OHB，ADM;DDP的体外平均抑制率明显高于VP－16，L－OHB和ADM，其他药物间无明显差异，且敏感率也较高(见表3)。

表2 化疗药物对大肠癌细胞的体外平均抑制率统计学方析(P值)

表3 化疗药物的敏感率

2.2 结肠癌细胞对化疗药物的敏感性

结果见表1，平均抑制率由大到小的化疗药物依次是MMC，DDP，5－FU，VP－16，L－OHB 和 ADM。用 SPSS 17.0统计软件包进行数据处理，单因素方差分析 P=0.001，表明6种化疗药物对结肠癌细胞的平均抑制率有显著性差异。经LSD分析，各化疗药物之间比较的 P值见表4。可见，在体外培养试验中，MMC和DDP对结肠癌细胞的体外平均抑制率明显高于VP－16，L－OHB，ADM;而5－FU的体外平均抑制率明显高于ADM;其他药物间无明显差异。MMC，DDP，5－FU的药物敏感率较高(表3)。

表4 化疗药物对结肠癌细胞的体外平均抑制率统计学分析(P值)

2.3 直肠癌细胞对化疗药物的敏感性

结果见表1，平均抑制率由大到小的化疗药物依次是MMC，DDP，5－FU，L－OHP，VP－16，ADM。用 SPSS17.0统计软件包进行数据处理，单因素方差分析 P=0.379，P＞0.05，虽然无显著性差异，但仍有一定的意义。各化疗药物之间比较的 P值见表5。就表1而言，MMC，DDP，5－FU的体外平均抑制率较其他3种化学药物高，且敏感率也较高(表3)，结果与大肠癌细胞相似。

表5 化疗药物对直肠癌细胞的体外平均抑制率比较统计学分析(P值)

3 讨论

本试验结果表明，6种临床常用的大肠癌化疗药物对体外培养的大肠癌细胞均有较高的平均抑制率，且结肠癌、直肠癌有着相似的规律;其中，MMC，DDP，5－FU的抑制率更高一些。由于MTT法阴性符合率为100%，体外耐药而临床治疗有效率为0，证明体外药物敏感性试验“假耐药”的可能性极小，故临床可根据耐药结果，不再使用无效的化疗药物，避免了不必要的药品浪费，使临床用药合理化[3]。对于体外敏感的药物，由于MTT法存在一些缺点，如标本的纯化程度、细胞悬液中的少许纤维细胞及血细胞、药物与细胞作用的时间以及二甲基亚砜的稳定性等，结果会受到一定影响，会出现一定数量的假阳性结果，因此若能对每例患者同时进行耐药基因测定，则更能提供可靠的化疗用药依据[4]。

因标本为大肠癌组织，考虑到大肠癌组织为粪便污染，取材后标本应浸泡在含高浓度抗生素液中，去污时应多次洗涤，以去除杂菌，标本应尽快处理，放置越久活力越低。另外，细胞悬液应尽量混匀，以免影响活细胞计数，从而影响结果。笔者是根据临床大肠癌用得比较多且较敏感的6种药物进行临床试验，表5中直肠癌的6种化疗药物体外平均抑制率比较无显著性差异，不能说明实验无意义，今后还要不断完善实验方法，为临床提供可靠的药敏结果，更好地为临床服务。

[1]周际昌.实用肿瘤内科学 [M].北京:人民卫生出版社，1999:482.

[2]刘德传，郭以河.MTT法测定大肠癌对化疗药物敏感性的试验研究[J].现代肿瘤医学，2009，17(4):699 －701.

[3]徐建明，宋三建，汤仲明，等.MTT体外药敏实验指导下的乳癌预见性化疗[J].中华肿瘤杂志，1997，19(2):153.

[4]周海茵，叶古祥，孙国娣.MTT法测定大肠癌化疗药物敏感性[J].现代诊断与治疗，2002，13(1):9－11.

Study on Detecting Sensitivity of Colorectal Cancer Cells to Chemotherapeutic Drugs in Vitro by MTT Assay

Hua Bing1，Wei Runxin1，Ma Ying1， Qiao Jing2
(1.Taizhou People's Hospital，Taizhou，Jiangsu，China 225300; 2.Nantong Medical College， Nantong，Jiangsu， China 226021)

ObjectiveTo study the in vitro sensitivity of colorectal cancer cells to chemotherapeutic drugs by MTT assay.Methods The colorectal cancer tissues from 36 cases were cultured in vitro.The inhibition rate to cancer cells for selected 6 kinds of commonly used chemotherapeutic drugs in clinic were determined by MTT assay.Results In 36 cases of colorectal cancer，the sensitivity of those 6 drugs from high to low was MMC，DDP，5 －FU，VP －16，L －OHB and ADM.Among 18 cases of colonic cancer，the sensitivity sequence of those 6 drugs from high to low was MMC，DDP，5 －FU，VP －16，L － OHB and ADM.Among 18 cases of rectal cancer，the sensitivity sequence of those 6 drugs from high to low was MMC，DDP，5－FU，L－OHB， VP－16 and ADM.Conclusion MMC，DDP and 5－Fu have highly sensitive to colorectal cancer，which can be used as the first choice of drugs.Colonic and rectal cancers have the similar regularity in sensitivity of chemotherapeutic drugs.

MTT assay;colorectal cancer;chemotherapy;drug sensitivity

R965;R979.1

A

1006－4931(2011)10－0023－03

华彬，副主任药师，主要从事临床药学工作，(电话)0523 －86361360(电子信箱)huayaoshi@sina.com.cn。

2010－08－01;

2011－01－05)