复合抑制剂对酪氨酸酶活性的相互作用研究*

王庆华，黄演婷，舒锦华

(1.广东药学院 基础学院//广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006;2.广州雅纯化妆品制造有限公司，广东 广州 510425)

皮肤的颜色深浅与表皮细胞黑色素浓度成正比，而酪氨酸酶在黑色素生成的系列反应中发挥了关键酶的作用。曲酸及其衍生物、熊果苷、氢醌和一些植物提取物常作为酪氨酸酶抑制剂用于美白化妆品［1－3］。目前对酪氨酸酶活性的抑制机理研究大多集中在单一抑制剂的作用［4－7］，而且酪氨酸酶抑制剂在实际应用中也多是单独添加到化妆品中，多种抑制剂复合使用则较为少见。为了追求最佳的酪氨酸酶活性抑制效果，研发人员开始尝试在化妆品中同时添加多种抑制剂成分。但多种抑制剂间的相互作用不一定是所期望的协同效应，也可能是拮抗或互不影响的简单相加效应。此外，在酪氨酸酶抑制剂与其它化妆品配方成分之间，如防腐剂、抗氧化剂、乳化剂等，对酪氨酸酶的抑制亦有可能产生相互影响，如何评价这些物质之间的相互作用是产品开发人员所必须考虑的问题。曲酸是目前美白化妆品中常用酪氨酸酶抑制剂型的美白成分;苯甲酸、肉桂酸具有防腐抗菌作用，而且两者对酪氨酸酶抑制作用动力学研究已较为清晰，是潜在的化妆品添加剂成分［5－7］。作者采用近年来常用的研究药物相互作用的等效线评价方法［8－11］，研究苯甲酸、肉桂酸和曲酸3种抑制剂复合使用时对酪氨酸酶活性的影响，为今后美白化妆品的研发探索一条新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

蘑菇酪氨酸酶，美国Worthington公司;L-多巴，美国Sigma公司;肉桂酸，曲酸，苯甲酸均为国产分析纯试剂;721分光光度计，上海第三分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酪氨酸酶活力测定 参见文献 ［12］，酪氨酸酶活力以催化L-多巴生成多巴醌的二酚酶活力衡量。试管中加入 L-多巴0.4 mL(1.0 mg/mL)，pH 6.8磷酸缓冲液2.4 mL，30℃水浴保温10 min后，加入酪氨酸酶0.2 mL(250 U/mL)混匀，酶促反应将L-多巴转化为红色产物多巴醌，在475 nm处有最大吸收。读取从混匀开始2 min时在475 nm处的吸光度A，酶促反应的速度用每分钟A475增加值来表示。

试管中加入底物 L-多巴0.4 mL(1.0 mg/mL)，然后加入不同质量浓度的抑制剂，抑制剂均以DMSO配制，酪氨酸酶0.2 mL(250 U/mL)，以磷酸缓冲液补足反应液总体积为3.0 mL，测定反应开始2 min时的吸光度，按如下公式计算酶活性抑制率。文中抑制剂的质量浓度均为抑制剂在测试体系中的终质量浓度。

式中A1为无抑制剂有底物时的吸光度;A2为无抑制剂无底物时的吸光度;A3为加抑制剂与底物时的吸光度;A4为加抑制剂无底物时的吸光度。

1.2.2 复合抑制剂的相互作用等效线图的绘制A、B两种抑制剂复合，以抑制剂A的质量浓度为横坐标，抑制剂B的质量浓度为纵坐标，连接横坐标上A抑制剂和纵坐标上B抑制剂单独作用时酶活性抑制50%的抑制剂质量浓度 (IC50)得一直线，即为两抑制剂具有简单相加性的IC50等效线，A、B单独作用的IC50以及95%置信限可以通过各自的对数剂量－效应关系的线性回归方程求得。酶活性抑制30%和70%的等效线则以IC30、IC70的数据作图。在图上标示出实验测得的各复合抑制剂的IC50(IC30、IC70)坐标点 (横坐标为复合物中A的质量浓度，纵坐标为B的质量浓度)，根据各点坐标与等效线的位置关系可判断两种抑制剂相互作用的效果。若复合物等效应的坐标点在等效线置信区间内，表示两抑制剂的抑制效果为相加;在置信区间下方，则为协同效应;在上方则为拮抗效应。3种抑制剂复合的等效线图是三维图形，3条坐标轴分别对应3种抑制剂的质量浓度，等效线图形则为一平面，作图方法与两种抑制剂的等效线图类似。

1.2.3 复合抑制剂相互作用的评价 A、B、C 3

种抑制剂复合相互作用的效应，可以用相互作用指数γ来评价。γ=ICa/ICA+ICb/ICB+ICc/ICC(若为两种抑制剂复合，则公式中只有其中两项相加)，ICA、ICB、ICC分别代表3种抑制剂单独作用产生某一抑制率时的质量浓度，ICa、ICb、ICc分别表示复合时与单独作用产生同一抑制率 (等效应)时的复合物中各自的质量浓度。γ=1，表示相互各抑制剂独立作用的简单相加效应;γ＜1为相互协同效应，γ值越小，协同效应越强;γ＞1为相互拮抗效应，γ值越大，拮抗效应越大。

1.2.4 抑制剂复合比例的选取 曲酸、苯甲酸、肉桂酸分别取不同剂量，测出各自的酪氨酸酶二酚酶抑制率，由对数质量浓度-抑制率图求得单一抑制剂的IC50，以各抑制剂的IC50的比值为基准作适当的倍数调整，从而确定一系列的复合比例，测定该比例的苯甲酸与曲酸、肉桂酸与曲酸以及这3种抑制剂同时复合的酶活性抑制率。

2 结果与讨论

2.1 肉桂酸、曲酸、苯甲酸单独作用对酪氨酸酶活性的抑制

肉桂酸、曲酸、苯甲酸单独作用时对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制作用呈对数剂量依赖关系，其对数剂量-抑制效应线性回归曲线如图1所示。曲酸的 IC30、IC50、IC70值分别为4.97、11.6、27.2 μg/mL，对数量效回归方程:i/%=53.4Logρ-6.98，R=0.993 2;苯甲酸的 IC30、IC50、IC70值分别为11.5、42.7、158 μg/mL，对数量效回归方程:i/%=34.5 Logρ－5.89，相关系数 R=0.989 0;肉桂酸的 IC30、IC50、IC70值分别为 21.8、87.0、350 μg/mL，对数量效回归方程:i/%=32.9Logρ－13.9，R=0.995 4。三者中以曲酸的抑制作用最强，其次为苯甲酸，肉桂酸最弱。

2.2 苯甲酸和曲酸复合对酪氨酸酶活性的抑制作用

由苯甲酸、曲酸单独作用得到的IC50值，定出苯甲酸、曲酸质量比为3.8∶1，分别取此比值的0.5、1.0、2.0倍，得到苯甲酸、曲酸质量比为1.9∶1;3.8∶1;7.5∶1的3种复合比例，测定这3种比例的苯甲酸和曲酸复合物对酪氨酸酶活性的抑制作用，作酶活性抑制50%的等效线图。表1结果显示3种比例的复合抑制剂对酪氨酸酶二酚酶的抑制均有显著的对数剂量-抑制效应线性关系，图2等效线图中显示3种比例的复合抑制剂的坐标点均位于远离等效区间的下方，说明此条件下对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用表现为较强的且具有统计学意义的相互协同效应。3种比例的复合抑制剂相互作用系数 γ1.9∶1=0.51;γ3.8∶1=0.45;γ7.5∶1=0.42，可见协同效应的强度与苯甲酸和曲酸的比例相关，实验条件下苯甲酸与曲酸按质量比为7.5∶1复合时的协同效应最强。

表1 苯甲酸和曲酸复合对酪氨酸酶活性抑制IC50Table 1 IC50of benzoic acid and kojic acid

2.3 肉桂酸和曲酸复合对酪氨酸酶活性的抑制作用

肉桂酸和曲酸复合对酪氨酸酶活性的抑制作用见表2。由肉桂酸、曲酸单独作用求得的IC50，确定酶活性抑制50%的肉桂酸和曲酸质量比为7.5∶1，按此比值的0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0倍，确定肉桂酸、曲酸质量比为3.8∶1、7.5∶1、10.8∶1、15∶1、22.5∶1、45∶1 共六种比例进行复合。六种混合物的抑制对数量效关系直线回归方程见表2，结果显示六种比例的复合抑制剂对酪氨酸酶二酚酶的抑制均有显著的对数剂量－抑制效应线性关系，由对数回归直线方程可求得不同比例的复合抑制剂中肉桂酸和曲酸复合的IC30、IC50、IC70值。

肉桂酸、曲酸复合作用的等效线见图3，图3b、图3c显示实验中所采用六种比例的复合抑制剂在IC50、IC70等效线图中的坐标点均位于等效线下方，说明此条件下对酪氨酸酶二酚酶的抑制表现为较强的且具有统计学意义的相互协同效应。而在图3a的IC30等效线图中，C、D、E、F四点落在等效线的置信区间内，显示此条件下该4种比例的肉桂酸和曲酸复合为简单相加效应。

上述不同比例复合的抑制剂，由酶活性抑制30%、50%和70%得出的γ值并不相同。表3显示同一比例下IC30的γ值均较IC50、IC70要大，说明使酶活性抑制30%时复合抑制剂的协同效应比酶活性抑制50%和70%时要弱，其中10.8∶1、15∶1、22.5∶1、45∶1 四种比例复合的为简单相加效应，此结果可能与复合抑制剂的质量浓度有密切关系，因为抑制酶活性30%所需的复合抑制剂质量浓度较低，低质量浓度条件下两种抑制剂可能互不影响，各自独立对酪氨酸酶发挥抑制作用，总体抑制效应表现为简单相加，随着抑制剂质量浓度增大，相互间的影响逐渐显著，协同效应逐渐明显。

以酶活性抑制30%和50%的等效评价，肉桂酸与曲酸按3.8∶1配比时协同效应最强;而以酶活性抑制70%的等效评价，肉桂酸与曲酸按22.5∶1配比时协同效应最强。可见协同的程度不仅与复合物中两组分的比例、复合抑制剂的质量浓度有关，还与评价的角度有关。

表2 肉桂酸和曲酸复合对酪氨酸酶活性抑制的IC30、IC50、IC70Table 2 IC30，IC50，IC70of cinnamic acid and kojic acid

图3 肉桂酸和曲酸复合作用的IC30(a)、IC50(b)和IC70(c)等效线图Fig.3 IC30(a)、IC50(b)and IC70(c)isobolographic plot of cinnamic acid and kojic acid

表3 肉桂酸和曲酸复合的相互作用指数Table 3 The interaction index of cinnamic acid and kojic acid

2.4 肉桂酸、苯甲酸和曲酸3种抑制剂复合对酪氨酸酶活性的抑制作用

肉桂酸、苯甲酸、曲酸以质量比7.5∶3.8∶1复合，复合抑制剂酶活性抑制50%的对数量效曲线方程为i/%=31.1Logρ+23.0，R=0.990 0，复合IC50为8.40 μg/mL。由3种抑制剂单独作用的IC50作三维等效线图。图中3条坐标轴对应3种抑制剂的质量浓度，中间的三角平面为相加效应的等效面，上下两侧的三角平面所夹区域为等效区间，靠近一角的坐标点为3抑制剂复合的等效质量浓度坐标点。三维视图显示复合抑制剂的IC50坐标点不在等效面区间内，远低于等效面，表明3种抑制剂的复合使用所产生的协同效应很明显。上述比例的复合抑制剂相互作用指数γ值为0.18，远小于1，也较前述两种抑制剂复合作用在酶活性抑制50%的γ值要小很多，说明这3种抑制剂复合产生的协同效应比其中两种复合的协同效应更为显著。

图4 肉桂酸、苯甲酸和曲酸复合的IC50三维等效线图Fig.4 Isobolographic plot of cinnamic benzoic acid，acid and kojic acid

从化学性质分析，肉桂酸、苯甲酸和曲酸混合时不发生化学反应，不会影响彼此的质量浓度。酪氨酸酶是一种含铜的金属酶，Cu2+参与构成酪氨酸酶催化反应的活性中心。肉桂酸 (苯丙烯酸)、苯甲酸的结构较为相似，均以羧基与铜原子形成复合物，是酪氨酸酶的非竞争性抑制剂;曲酸 (5－羟基－2－羟甲基－1，4－吡喃酮)通过5位羟基和4位酮基与Cu2+络合，是酪氨酸酶的混合型抑制剂［5－7］，由此可知3种抑制剂均是与酪氨酸酶活性中心以外的部位结合。若这3种抑制剂都结合于酪氨酸酶活性中心外的同一部位，则它们之间存在“竞争”关系，共同存在时酪氨酸酶只能与其中一种抑制剂结合，抑制剂间发生协同作用的可能性较小。因此推测肉桂酸和曲酸或苯甲酸和曲酸可能结合于酪氨酸酶活性中心外的不同部位，其中一种抑制剂与酶结合以后，使酶的构象改变，导致其它抑制剂与酶的作用受到影响;或者多种抑制剂同时结合酶分子，共同影响酶的催化效应，从而表现出相互协同的效应。

3 结论

肉桂酸、苯甲酸、曲酸均是是酪氨酸酶的抑制剂。苯甲酸和曲酸复合，对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制表现为明显相互协同效应，协同效应的程度与复合比例相关。肉桂酸和曲酸复合，在复合物质量浓度较低时，对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制多表现为各自独立的抑制作用，倾向于简单相加效应;随着复合抑制剂质量浓度增加，抑制率加大，呈现明显的协同效应，而且协同效应的大小与两组分的比例、质量浓度有关。苯甲酸、肉桂酸和曲酸3种抑制剂复合，表现出非常显著的协同效应，协同的程度比两种抑制剂复合的协同程度更强。苯甲酸、肉桂酸和曲酸协同效应的机制，需进一步研究探讨。本研究提示:酪氨酸酶抑制剂的复合使用，有可能产生协同效应，达到同等抑制效果时所需抑制剂总量比抑制剂单独作用时要少，这为研发高性价比的美白化妆品提供了一条新思路。

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