不同盐对鲤鱼肌原纤维蛋白结构和凝胶特性的影响＊

孔保华,李明清,夏秀芳

鲤鱼 (Comm on carp,Cyprinus carpio)在淡水鱼中所占比例很大,是一种非常重要的淡水资源。淡水鱼除了鲜活食用外,大部分加工成鱼糜制品。影响鱼糜制品质量的最主要的因素是肌原纤维蛋白,它是鱼肉中含量最多的蛋白质,它结构和性质直接影响鱼肉制品的结构和功能特性[1]。目前国内外研究较多的是以鱼糜为原料,添加非肉蛋白质和胶类对鱼糜质量的影响[2],而添加不同盐对鲤鱼肌原纤维蛋白的结构和功能性质影响的研究并不多。在加工过程中,一些盐类会对肉糜类制品的品质产生影响,一定离子强度的盐溶液可以提高肌原纤维蛋白的溶解性,改善凝胶特性,其中钠离子和钙离子对鱼肉中肌原纤维蛋白的功能特性影响较大[3-4]。肌原纤维蛋白主要由肌动蛋白和肌球蛋白构成,是鱼肉的结构蛋白,对鱼肉制品的品质有重要的影响[5]。在肉制品加工中利用盐溶液对肌肉蛋白的凝胶效应可以提高产品的品质,例如在肉中注入盐水可以明显提高肉的保水性和多汁性,并提高鱼糜类制品的凝胶强度[6],在鱼糜中添加焦磷酸钠可以使鱼糜凝胶的微观网状结构变得细腻致密,从而可以保留更多的水分[7-8]。因此,本文以鲤鱼为原料,提取肌原纤维蛋白后,添加不同浓度的NaCl,CaCl2和 Na4P2O7,研究盐类对鲤鱼肌原纤维蛋白的结构特性和凝胶特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜活鲤鱼 (购于家乐福超市),体重约为 600 g。

1.2 仪器与设备

HR2860型飞利浦斩拌机,AL-104型精密电子天平 (上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司),HH-4型数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公司),TA-XT plus型质构分析仪 (英国 Stable Micro System公司),冷冻离心机 (上海分析仪器公司),pHS-25型 pH计(上海精科雷磁仪器厂),JD500-2型电子天平 (沈阳龙腾电子称量仪器有限公司),精密电子天平 AL-104(上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司),紫外可见分光光度计UT-1800(北京普析通用仪器有限公司),精密增力电动搅拌器 JJ-1(常州国华电器有限公司),Mini-4型电泳槽 (美国 Bio-rad公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 鲤鱼肌原纤维蛋白的提取

鲤鱼宰杀去皮后,取背部白色肉。肌原纤维蛋白提取参照 Chin等的方法[9-10]并适当修改。将鱼肉搅碎,加入 4倍体积的 20 mmol/L pH值 7.5的冰磷酸盐缓冲溶液均质,均质 2次,每次 30 s,时间间隔 30 s,将其在 4℃冷冻离心机中 8 000 g离心 10 min,除去上清液。取沉淀用 4倍体积 pH值 7.5的 20 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液清洗沉淀,重复 3次,最后一次清洗后用 5层纱布过滤,所得滤液离心。沉淀为肌原纤维蛋白样品,用凯氏定氮方法测定其蛋白含量。将肌原纤维蛋白配制为蛋白含量为 40 mg/mL的溶液,分别添加不同浓度的 NaCl、CaCl2和 Na4P2O7,进行肌原纤维蛋白的溶解性、凝胶性、凝胶微观结构、浊度和表面疏水性等指标的测定。

1.3.2 肌原纤维蛋白等电点的测定

等电点的测定参照 Tang[11]的方法,称取肌原纤维蛋白样品与蒸馏水 1∶100(g∶mL)混合,用 0.1 mol/L NaOH调节 pH值 8.0,室温下磁力搅拌 1h后,4 000 r/min离心 20 min,取等量上清液,用 0.1 mol/L HCl调至不同 pH值 (3～6.5)沉淀蛋白质,离心后采用双缩脲法分别测定离心沉淀前后上清液中肌原纤维蛋白,上清液中蛋白质残留率最低时的 pH值即为肌原纤维蛋白的等电点。其公式如下:

1.3.3 肌原纤维蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

参照 Laemmli的 SDS[12]不连续电泳方法,分离胶浓度 10%,浓缩胶浓度 5%,电极缓冲液为 0.05 mol/L Tris,0.384 mol/L甘氨酸,0.1%SDS(pH值8.3)的混合溶液。电泳胶的厚度为 1 mm,进样量为15μL,进样浓度为 1 mg/mL,电泳开始时调节电压为80 V,当样品进入分离胶后将电压调节为 120V。

1.3.4 肌原纤维蛋白凝胶质构 (TPA)的测定

将肌原纤维蛋白溶液 (40 mg/mL),分别添加不同浓度的 NaCl、CaCl2和 Na4P2O7,在 80℃水浴下加热 45 min,冷却,放置 4℃冰箱 12 h,形成肌原纤维蛋白凝胶。肌原纤维蛋白凝胶 (直径 30 mm高度 25 mm)在室温下放置 30 min,用质构分析仪测定。将待测样品置于测定平台上固定好,室温下利用物性分析仪进行测量。以质构剖面分析方法 (texture profile analyses,TPA)测定凝胶的硬度和弹性等,选用的参数分别为:S MS P/50探头,测前速度 5 mm/s,测试速度 1 mm/s,触发力 1g,压缩距离 50%。所有样品做 3次平行试验,结果取平均值。

1.3.5 肌原纤维蛋白凝胶微观结构的观察(扫描电镜)

取肌原纤维蛋白凝胶样品,切成约 (2×5)mm的小条,用 pH值 6.8浓度为 2.5%的戊二醛浸泡 12 h固定。用 0.1mol/L pH值 6.8磷酸缓冲液洗涤 3次,每次 10 min。分别用体积分数 50%、70%、80%和 90%的乙醇进行脱水,每次 10 min;然后用 100%乙醇脱水 3次,每次 10 min。最后用三氯甲烷脱脂1h,再分别用 100%乙醇∶叔丁醇体积比为 1∶1和叔丁醇进行置换各 1次,每次 15 min。样品用 ES-2030(H ITACH I)型冷冻干燥仪进行干燥。将凝胶样品观察面向上紧密粘贴在扫描电镜样品台上,在离子溅射喷金过程中,用 E-1010(Giko)型离子溅射镀膜仪将样品表面喷金,处理好样品之后,放入扫描电镜的样品盒中待检,加速电压为 5kV,放大倍数为 300倍,进行扫描电镜观察。

1.3.6 肌原纤维蛋白表面疏水性的测定

表面疏水性的测定依据 Chelh的方法[13]。将肌原纤维蛋白溶于 pH值 7、20 mmol/L的磷酸盐溶液中,蛋白浓度为 5 mg/mL,在 80℃加热 30 min,取 1 mL蛋白溶液,加入 200μL浓度为 1 mg/mL溴酚蓝,以无肌原纤维蛋白的磷酸盐溶液为对照。在 2 000 g离心 15 min,取上清液稀释 10倍,在 595 nm处测定吸光值。表面疏水性用以下公式表示:

式中:A对照为对照组的吸光值,A样品为处理组的吸光值。

1.3.7 肌原纤维蛋白浊度的测定

肌原纤维蛋白浊度的测定按照 Benjakul等的方法测定[14-15]。肌原纤维蛋白溶液配制为 1 mg/mL,溶液取 5 mL,分别在 80℃的水浴锅中加热 30 min,冷却后在 600nm处测定吸光值。以不加蛋白的空白溶液为对照。

1.3.8 统计分析

每个试验重复 3次,结果表示为平均数 ±SD。数据统计分析采用 Statistix 8.1(分析软件,St Paul,MN)软件包中 LinearModels程序进行,差异显著性(P＜0.05)分析使用 Tukey HSD程序。采用 sigmaplot 11.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 鲤鱼肌原纤维蛋白等电点的测定

图1 鲤鱼肌原纤维蛋白的等电点

由图1中可以看出,鲤鱼肌原纤维蛋白在不同pH值条件下经过沉淀后,上清液中蛋白含量呈先下降后升高的趋势。上清液中残留的肌原纤维蛋白含量在 pH值 5.5时最低,蛋白含量趋向于 0,而在 pH值 5.5附近残留蛋白质含量均较高。由此可见,pH值 5.5为肌原纤维蛋白的等电点,该结果与 Fennema[16]的结果一致。

2.2 肌原纤维蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

肌原纤维蛋白的电泳图谱如图2所示。从图2中可以得出,肌原纤维蛋白主要包括 17～20 ku的肌球蛋白轻链、35 ku的肌原蛋白 (troponin,T)的一个亚基 (原肌球蛋白结合亚基)、36 ku的原肌球蛋白(tropomysin)、43 ku的肌动蛋白 (Actin)、100 ku的副肌球蛋白 (paramyosin)和 220 ku的肌球蛋白重链,结果与Lametsch等[17-18]相一致。在肌原纤维蛋白中添加 NaCl,CaCl2和 Na4P2O7的蛋白样品中,会使肌动蛋白和肌球蛋白轻链条带变深,同时在条带上部(66～200 ku)出现分子质量较大细小条带,而肌原蛋白 T的条带变浅,说明添加这 3种盐会使一些蛋白质发生一定的聚合作用。特别是添加磷酸盐 Na4P2O7的样品聚合程度要高一些。以上结果与 Glibowski[19]试验一致。

图2 肌原纤维蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

2.3 添加不同盐对肌原纤维蛋白凝胶硬度和弹性的影响

由图3可知,NaCl、CaCl2和 Na4P2O7的添加使肌原纤维蛋白凝胶的硬度下降。在添加Na4P2O7组中,肌原纤维蛋白凝胶硬度比添加 CaCl2组中凝胶硬度下降的较少 (P＜0.05)。添加 NaCl组和添加Na4P2O7组的肌原纤维蛋白凝胶硬度差异不显著 (P＞0.05)。3种盐的添加使肌原纤维蛋白凝胶弹性大都呈现下降的趋势。在添加 NaCl和 CaCl2组中,肌原纤维蛋白凝胶的弹性随着盐添加量的增大而降低。添加 NaCl组中肌原纤维蛋白凝胶的弹性比添加CaCl2组的弹性要下降少。在添加 Na4P2O7组中,肌原纤维蛋白凝胶的弹性先增加然后减少,在添加量为0.5%处凝胶的弹性达到最大值。且添加 Na4P2O7组凝胶的弹性显著高于 NaCl和 CaCl2组 (P＜0.05)。

盐对肌原纤维蛋白的变性机理仍在研究中,因此蛋白凝胶的形成过程中盐的作用也不是很明确。以上试验结果可能的原因是,一些盐可以提高蛋白变性的温度,这些盐可以加强蛋白的水合作用,且与水价键结合能力较弱;而另一些盐使蛋白凝胶的变性温度降低,这些盐降低蛋白的水合作用且水合能力较强,此外,加热形成凝胶中,由于盐浓度提高蛋白变性温度,影响了凝胶形成的第二阶段的蛋白之间聚合[20]。也可能因为鱼肉中含有大量的转谷氨酰胺酶,这些酶在离子强度较低时更加有效地将肌球蛋白交联,盐的添加降低了转谷氨酰胺酶的活性,使凝胶的强度下降,此外,添加焦磷酸钠提高了肌原纤维蛋白的溶解性,超出了凝胶的最适条件。因此添加 3种盐蛋白凝胶的硬度和弹性呈现下降的趋势。

图3 不同盐对肌原纤维蛋白凝胶硬度和弹性的影响

2.4 添加盐对肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响

肌原纤维蛋白添加 0.5%NaCl、CaCl2和 Na4P2O7后形成凝胶微观结构的变化如图4所示。由图4中可以看出,添加 NaCl所成凝胶结构比对照组凝胶样品致密,使细胶束聚集增加,网状孔隙变小,网络结构比较有序,这样的结构能更好的保持住凝胶的水分。添加 CaCl2凝胶微观结构变粗糙,胶束分布不均匀,并且结构中出现碎片,有的形成断层状,使凝胶的吸水和保持水分的能力降低,凝胶的孔径变大结构松散。添加Na4P2O7的肌原纤维蛋白凝胶表面致密,孔径很小,而对照组凝聚空间多孔不规则、粗糙。

图4 不同盐对肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响(×300)

2.5 盐浓度对肌原纤维蛋白浊度和表面疏水性的影响

浊度可以表明蛋白质的凝聚程度,反映了溶液中蛋白质悬浮粒子的大小和数量。没有发生凝聚的蛋白质分散时悬浮颗粒直径较小,浊度小;蛋白质聚集后,悬浮颗粒直径增大,浊度升高。不同添加物对肌原纤维蛋白浊度的影响如图5所示。

图5 不同添加物对肌原纤维蛋白浊度的影响

3种盐明显降低了肌原纤维蛋浊度,在同一盐浓度下 CaCl2影响最明显,且与对照组相比差异显著 (P＜0.05)。这是因为肌原纤维蛋白是盐溶性蛋白,在盐溶液中蛋白溶解蛋白分散,吸光值下降,在水溶液中蛋白聚集,吸光值最大。因此,在生产鱼类制品时要充分利用肌原纤维蛋白更易溶解于盐溶液中的特性,来提高鱼糜类制品的质量。图6为不同盐对鲤鱼肌原纤维蛋白表面疏水性的影响。NaCl和 Na4P2O7显明的降低肌原纤维蛋白的表明疏水性,这也说明蛋白质的溶解性增加。在添加 Na4P2O7的肌原纤维蛋白组中下降程度比添加 NaCl组的表面疏水性下降程度大 (P＜0.05)。在添加 NaCl条件下,肌原纤维蛋白表面疏水性在 0～0.25%下降显著 (P＜0.05),进一步增大浓度,肌原纤维蛋白的表面疏水性变化不显著 (P＞0.05),可能因为肌原纤维蛋白是盐溶性的蛋白,在一定离子强度的盐溶液中,可以增加肌原纤维蛋白的溶解性[7]。添加 CaCl2的组中,由于 CaCl2与溶液中的试剂反应,方法不适用,所以没有将数据列出。

3 结论

图6 不同盐浓度对鲤鱼肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

将 NaCl、CaCl2和 Na4P2O7添加到鲤鱼鱼糜中,对肌原纤维蛋白的结构和凝胶特性产生不同的影响:盐类使肌原纤维蛋白发生一定程度的聚集和降解、表面疏水性降低,溶解性增加;同时也降低了肌原纤维蛋白凝胶硬度、弹性、浊度,且随着盐浓度的增加影响越明显,其中 CaCl2对肌原纤维蛋白的影响最明显。从肌原纤维蛋白凝胶微观结构可以看出,NaCl和Na4P2O7使凝胶的微观结构变致密,CaCl2使凝胶微观结构变松散。3种盐对鲤鱼肌原纤维蛋白的分子量影响不明显。因此,在鲤鱼制品深加工过程中,适当添加各种盐类可明显影响制品的质量。

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