苹果中正己醇降解酶的提取＊

朱静,师俊玲,刘延琳

正己醇是食品加工,特别是酒类酿造中经常产生的一种杂醇油类高级醇[1],具有强烈的刺激性气味,对食品风味有不良影响。过多地摄入会使人的神经系统充血,引起头痛,具有一定的生理毒性[2-3],即人们常说的白酒上头的原因[4-5]。另外,正己醇也是引起大豆豆腥味的主要成分之一[6-7]。近年来,随着人们对正己醇危害性认识程度的加深,以及检测技术的发展和检测灵敏度的提高,人们对正己醇的生理毒害的重视程度也越来越高。适当降低产品中正己醇含量对提高食品质量和安全性有重要意义。

目前,正己醇的转化主要是化学方法,如将正己醇转化为正己醛[8～10]或己酸己酯[11]。但是,化学催化会引入新的不安全因素,不适用于食品加工。酶法转化则因其具有催化效率高、安全、对环境友好等优点在食品加工方面有很好的推广应用前景。已有研究显示,正己醇大量地存在于各种植物组织中,呈现青草气息的水果味,是苹果鲜果和苹果汁中香气成分的重要组分之一[12-14]。植物体内正己醇主要由氨基酸的分解代谢或脂肪酸的合成代谢而产生[15-16]。苹果中的正己醇主要来自于果实发育过程中的脂肪氧化酶和醇脱氢酶对脂肪酸的β氧化作用[16]。Kim和Grosch[17]研究发现,苹果中的脂肪氧化酶 (LOX)能形成氢过氧化物,对苹果中正己醇和正己醛的生成有重要作用;正己醛则在苹果醇脱氢酶 (ADH)的作用下生成正己醇,因而成熟的苹果中同时存在正己醛和正己醇[18-19]。由此推测,如果上述反应为可逆反应,则在苹果体内必然存在将正己醇转化为正己醛或其它物质的酶系。为此,利用苹果体内的酶系降低正己醇含量的生物转化是有可能的。我们的前期研究也证明了苹果中的确存在能够降低正己醇的酶系,并对其作用的最适 pH和最适温度有了初步了解。本文拟在前期研究的基础上,旨在为苹果中的正己醇降解酶寻求较好的制备方法,并进行初步纯化的探索,为其进一步应用提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

苹果:市售成熟的红富士苹果,无伤痕、无病害、品质良好,购于陕西杨凌水果市场。

主要试剂:正己醇,色谱纯,国药集团化学试剂有限公司进口分装;丙酮、柠檬酸、柠檬酸钠、三氯乙酸(TCA)、聚乙烯聚吡咯烷酮 (PVPP)、聚乙二醇辛基苯基醚 (TritonX-100)、十二烷基硫酸钠 (SDS)、过硫酸铵 (AP)均为国产分析纯;考马斯亮蓝 G-250、考马斯亮蓝 R-250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、四甲基乙二胺 (TEMED)、甘氨酸、牛血清白蛋白,为优级纯。

1.2 仪器与设备

HZS-H水浴振荡器,哈尔滨市东明医疗仪器厂;GC9800(FP)气相色谱仪,上海科创色谱仪器有限公司;丹佛 T-203型电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;ST-303织匀浆器,广东美斯特电器;F-101电动搅拌器,巩义市英峪予华仪器厂;GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机,海安亭科学仪器厂;UB721紫外分光光度计,日本岛津;DYCZ-22A型电泳槽,北京六一仪器厂。

1.3 粗酶的提取方法

将多个同一品种苹果 (4℃预冷 2 d)果皮部分(厚度 0.4～0.5 mm)混匀之后,及时称取 200 g,按照以下几种方法分别处理,所得粗酶液均定容至 100 mL,冷藏备用。

缓冲体系:0.1 mol/L的 4℃预冷的 pH值 4.6的柠檬酸 /柠檬酸钠缓冲溶液。

(1)缓冲溶液提取法:称取上述苹果果皮 200 g,溶解于 100 mL上述缓冲体系,用组织匀浆器打碎,匀浆液超声波破碎 20 min(冰浴),破碎功率固定为 20 kHz、20 W,再用 4层干净纱布过滤,取滤液在 4℃下4 000 r/min离心 30 min,取上清液冷藏于 4℃冰箱,备用。

(2)丙酮粉提取法[20]:在 200 g上述苹果果皮中加入 50 mL冷冻丙酮 (-30℃),在高速组织匀浆机中打浆,将果浆转入烧杯中,加入 100 mL冷冻丙酮,用玻璃棒缓慢搅拌 1 min,用真空泵抽滤,滤渣再用100 mL冷冻丙酮溶解,经玻璃棒搅拌均匀后,再次抽滤。如此反复,直至滤渣为无色为止,滤渣转入真空干燥器至干,即得粗酶粉。将上述粗酶粉溶解于 100 mL上述缓冲体系中,在 4℃下用电子恒速搅拌器缓慢搅拌 30 min,再用 4层干净纱布过滤,取滤液在 4℃下 4 000 r/min离心 30 min,取上清液冷藏于 -40℃冰箱,备用。

(3)TritonX-100提取法[21]:同 (1)但缓冲体系中含 1%的 TritonX-100。

(4)TritonX-100+PVPP提取法[22]:同 (1)但缓冲体系中含 1%的 PVPP和 TritonX-100。

1.4 正己醇降解能力的测定

1.4.1 反应体系

正己醇浓度为 1.3 g/L的 10 mL柠檬酸 /柠檬酸钠缓冲液 (pH 4.6,浓度 0.1 mol/L),酶液用量 2 mL。

1.4.2 实验方法

测定粗酶液的正己醇降解能力时,直接在 1.4.1反应体系中加入 2 mL粗酶液进行反应,对照均为:用2 mL上述缓冲体系代替酶液的反应体系。反应条件:37℃、100 r/min水浴,反应 4 h。反应结束后,及时取样,立即冰浴后置于 4℃下贮存,用于测定正己醇残留量。每种体系进行 3个平行试验。

1.5 提酶方式及初步纯化对正己醇的酶促降解影响

1.5.1 提取方式对酶活力影响

在 1.4.1反应体系中加 1.3中 (1)、(2)、(3)和(4)提取粗酶液各 2 mL,按 1.4.2中实验方法测定正己醇降解能力。

1.5.2 纯化方法对酶活力影响

取 2 mL粗酶液,分别加入 (NH4)2SO4使饱和度达到 70%,4℃静置过夜,10 000 r/min离心 30 min,沉淀溶于 pH值 4.6,0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,经同样缓冲液透析,按 1.7.3和 1.4.2的方法测定蛋白质含量和正己醇的降解能力。

1.5.3 蛋白质分子量及蛋白质浓度的测定 (SDSPAGE电泳)

参考 Laemmli[23]的方法进行。对采用 4种方法提取的酶及其 70%(NH4)2SO4盐析、透析处理的样品进行电泳分析[24]。聚丙烯酰胺凝胶组成为 4%(w/v)丙烯酰胺 (浓缩胶)和 12%(w/v)丙烯酰胺 (分离胶),进样量为 20μL。电泳所用电流,浓缩胶 20 mA、分离胶 15 mA。剥胶后用 120 g/L TCA浸泡 10 min,固定蛋白质样品。染色过夜后进行脱色处理,脱色完毕后用宝生物 (Bio-rad)呈像系统分析。

1.6 酶的初步纯化(丙酮粉法提酶)

1.6.1 (NH4)2SO4盐析分离最适饱和度的确定

提取的酶液参考谢栋[25]的方法,确定最适(NH4)2SO4饱和度。取 9个离心管,各加粗酶液 2 mL,分别加入 (NH4)2SO4使饱和度达到 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%和 100%,4℃静置过夜,10 000 r/min离心 30 min,沉淀溶于 pH值 5.4,0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,经同样缓冲液透析,用聚乙二醇 6 000浓缩,测定每管的蛋白质含量和正己醇的降解能力。

1.6.2 (NH4)2SO4盐析分级沉淀

边搅拌边缓慢在粗酶液中加固体 (NH4)2SO4至30%饱和度,4℃静置 8 h,10 000 r/min离心 10 min,弃沉淀,上清液中再加固体 (NH4)2SO4至 70%饱和度,4℃静置 8 h后 10 000 r/min离心 10 min,同

1.6.1 处理。

1.7 指标检测

1.7.1 正己醇含量的测定

反应结束后的待测样,用气相色谱仪 (GC9800/FI D)按照顶空进样法检测正己醇残留量[26],以体积分数 5%4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液作内标。

气相检测用色谱柱为弹性石英毛细管柱 DBWAX-10(Φ0.53 m ×30 m),载气 N2,进样量 300μL,采取程序升温,即第 1阶段初始温度 55℃,初温保持时间 3 min,升温速率:15℃/min,终止温度 200℃,终温保持时间 3 min;第 2阶段,初始温度 0℃,升温速率 0℃/min,终止温度 0℃。

1.7.2 正己醇降解率的计算

通过内标法获得对照和样品中正己醇的保留时间和峰面积,以与每个处理相应的对照为基准,计算正己醇降解率。

式中,A0为对照的正己醇峰面积;A1为加酶后正己醇峰面积。

1.7.3 蛋白质含量检测

[26]所述方法,采用考马斯亮蓝 G-250法检测粗酶液中蛋白质含量。

1.7.4 单位蛋白质正己醇降解量

1.7.5 酶的纯化倍数

2 结果与分析

2.1 提酶方式及初步纯化对正己醇的酶促降解影响

Prisky等研究发现,在非离子洗涤剂 Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)存在的情况下,苹果中的Lox酶的活性减小,说明苹果中的 Lox酶可能与细胞膜有关,需采用丙酮等有机溶剂或加入表面活性剂处理的方法提取。而大多数蛋白质均可溶于水、稀盐等溶液中,因此考虑用不同的溶剂提取酶。

图1显示了用 4种不同溶剂进行提取所得粗酶液及其纯化后蛋白的正己醇降解能力。结果显示,方法 (3)和 (4)的提取缓冲液中加入 TritonX-100或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮),所得酶液的活性均有显著提高。这是因为 TritonX-100和 PVPP属于非离子型表面活性剂,能够破坏细胞膜的脂膜结构,从而利于膜上酶蛋白的释放。而作为非离子型溶液,丙酮提取所得酶液的活性也比较高,而且在盐析后,其活性远远高于用缓冲液体系提取所得酶液,可能是丙酮为有机溶剂也利于膜上蛋白的释放,提取过程中去除了抑制酶活的糖份 (总糖去除率为 81.98%)或盐析和透析过程中去除了粗酶中抑制因子的原因。

提取所得粗酶液中还含有其它杂质,特别是糖份。这些物质的存在都会给后续的分离纯化带来困难。因此,粗提液中的杂质含量越少越好。在此,重点考察了提取液的含糖量。由图2可以看出,丙酮法所得酶液中糖含量远远低于缓冲液提取体系。这是因为丙酮在提取的过程中还有除糖、脱色、脱脂等作用。

图1 不同提取方法所得粗酶液的正己醇降解能力

图2 不同提取方法所得酶液中的总糖含量

不同提取方法所得酶液的特性对比见表1。可以看出,丙酮法所得粗酶液的总正己醇降解活性较差,但其单位酶活很高,是含 TritonX-100,PVPP缓冲液的 1.10～1.87倍。且丙酮粉法所得酶量较少,仅为 5.0 g(200 g苹果提取)左右。这与李立祥等研究结果类似[28]。考虑到正己醇降解酶的应用,所得酶制剂不仅要考虑酶活性,更要着眼酶制剂本身的活性、体积和应用性。曲拉通法和曲拉通 +PVPP法所得粗酶液的活性虽然略高,但酶液体积大,不易贮存,尚需进行浓缩、提纯才能达到应用要求,不利于酶的应用。相对而言,丙酮粉法虽对正己醇降解酶活性有所损失,但纯化倍数最高,加上其酶粉本身活性尚可、体积小和便于贮存、可以直接应用,因此在应用上具有优势。

提取方法 (2)、(3)和 (4)纯化倍数分别为 1.12、0.90、0.61,丙酮粉法提取的酶液在经过盐析和透析处理后的酶活性增加幅度最大 (增加 49.28%)。这与马歇克的研究结果相同[29]。即,在纯化的初始阶段,酶的总活性表现为有所增加。这是因为盐析和透析过程中除去了存在于初始提取物中的抑制因子,或者由于样品中的物质种类繁多而使活性未能呈现出量的线性依赖性。

表1 不同提取方法所得酶液的特性

丙酮粉法所得粗酶的蛋白含量低于含 TritonX-100,PVPP缓冲体系,但经过初步纯化后,其正己醇降解酶活力最大,且纯化后蛋白含量明显高于纯化前。这说明,用含 TritonX-100,PVPP缓冲液体系所得酶液中多出的蛋白主要是杂蛋白,而不是酶蛋白。

综合考虑,确定丙酮粉法用于苹果中正己醇降解酶的提取。

2.2 蛋白质分子量及蛋白浓度的测定(SDS-PAGE电泳)

要分离纯化未知酶系,首先要确定目标酶的分子量等基本特性。在此,主要考察了粗酶中总蛋白的特性,而且侧重分析了丙酮法所得粗酶液中的蛋白分布。由粗酶的全蛋白电泳图谱 (图2)可以看出,丙酮粉法有 10个条带,蛋白分子量分布范围较宽,且条带颜色较深,说明蛋白含量较高;其它 2种方法所得粗酶中只有 3条带,蛋白分子量范围较窄,且条带颜色较浅,说明蛋白含量较少。由此推测,正己醇降解酶可能与细胞粒上的脂类物质结合较紧,需采用丙酮等有机溶剂的方法提取。

图2 不同提酶方法及部分纯化后蛋白的 SDS-PAGE

总体来看,小分子蛋白颜色深,含量较高,而大分子蛋白颜色较浅,含量较少。

经过硫酸铵处理过的酶液条带颜色上有所增加,尤其是加入 TritonX-100的方法,经过处理后条带数量和颜色均有所增加。据陈惠等研究[27]可知,硫酸铵对酶有显著的保护作用,盐的添加能显著改善酶的热稳定性。因为盐类有离子键作用,当酶的活性中心含有离子作为配位体时,盐离子就能稳定酶的构象。另外,盐作为水分子的替代物占据水的位置,排除自由水对酶造成的不稳定化影响。但曲拉通 +PVPP法处理后却减少了,具体的原因还需进一步研究。

2.3 酶的初步纯化

2.3.1 丙酮粉法提酶 (NH4)2SO4盐析分离最适饱和度的确定

一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。硫酸铵沉淀常用作实验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种方法进行粗分离。

由图3可见,随着硫酸铵饱和度的增加,所得蛋白的沉淀量和沉淀物的酶活均呈先上升后下降的趋势,并分别在硫酸铵饱和度 60%和 70%时达到最大值。硫酸铵饱和度小于 30%时,蛋白沉淀量和沉淀物的酶活都很低。硫酸铵饱和度为 60%时所得蛋白质的沉淀量虽然最大,但其酶活并未达最大值,说明此时沉淀下来的蛋白质主要是杂蛋白。综合考虑,选用硫酸铵饱和度为 30%～70%。

图3 (NH4)2SO4饱和度与蛋白析出量、酶活的关系

2.3.2 丙酮粉法提酶 (NH4)2SO4盐析分级沉淀

对粗酶提取液进行分级沉淀,结果发现分级沉淀所得蛋白的正己醇降解率为 88.56% ±0.985%,说明条件选择合适。

3 讨论与结论

3.1 讨论

(1)通过酶法转化降解正己醇含量具有专一性强、无毒副作用、对环境友好等优点,在提高食品质量与安全性,以及对于正己醇高污染区的环境修复等方面都有重要意义。苹果中正己醇降解酶是其本身产生的酶类,苹果是人们日常食用的水果。从中提取的酶类是天然的、安全的,在食品加工中具有很好的应用潜力。本文确定了苹果中正己醇降解酶的最适提取方法,并对粗酶的初步纯化进行探讨,为进一步研究提供了重要依据。

(2)生物转化法降低正己醇是一个较新的课题,其中的作用机制、内在机理尚不清楚。虽然已有研究发现,植物体内的正己醇可在脂肪氧化酶 (LOX)的作用下转化为正己醛[30],在乙酸的参与下经醇酰基转移酶 (AAT)转化为乙酸己酯或丁酸己酯[31],在脱氢酶 (ADH)的作用下生成己醛[32],但有关苹果中酶系对正己醇的体外转化作用的研究还未见报道。本文的研究也只是处于研究的最初阶段,更深层的理论还有待进一步研究。

(3)苹果中正己醇降解酶的作用效果有望得到进一步提高。目前,人们对于正己醇在苹果内的代谢途径已经有了比较透彻的了解。参考这些代谢途径,可望在改变反应条件和酶的性质研究等方面获得较大突破。由此,将有望进一步提高降解酶的作用效果。

3.2 结论

采用不同方法从苹果中提取正己醇降解酶,优选最适的提酶方式,并研究了最适提酶方式下提取酶初步分离纯化。结果显示:采用丙酮粉法提酶较适合,且 SDS-PAGE电泳结果表明粗酶液和经硫酸盐处理后的条带分布有所变化。30%～70%为最适的(NH4)2SO4盐析浓度,然后对酶液进行梯度盐析,正己醇降解率为 88.56% ±0.9847%。

参考文献

[1] 张跃廷,刘琼,王佐民.浅谈杂醇油 [J].酿酒,2002,29(5):18-20.

[2] PerbelliniL,D De Grandis,Semenzato F,et al.An experimental study on the neurotoxicity of n-hexane metabolites:Hexanol-1 and hexanol-2[J].Toxicology andApplied Pharmacology,1978,46(2):421-427.

[3] Gauke Veenstra,CatherineWebb,Hans Sanderson,et al.Human Health Risk Assess ment of Long Chain Alcohols[J].Ecotox Environ Safe,2009,72(4):1 016-1 030.

[4] 周新虎,崔如生.引起白酒口干、上头问题的初探[J].酿酒科技,2001,(5):44～45.

[5] 张跃廷,刘琼,王佐民.浅谈杂油醇 [J].酿酒,2002,29(5):18-20.

[6] 谢继志,肖丽霞,夏玉雷,等.脱腥方法对豆浆中正己醛和正己醇含量的影响[J].江苏农学院学报,1996,17(1):155-173.

[7] 徐敬华,高保军,贾振宝.豆制品中豆腥味的产生原理及消除方法[J].中国乳品工业,2002,30(5):78-80.

[8] 周广栋,郭晓红,刘延.正己醇氧化生成正己醛磷钨杂多酸催化剂的过氧化氢分解活性[J].分子催化,2001,15(4):267-272.

[9] 周广栋,郭晓红,吕学举.氧化镁负载钼钒磷酸铜催化剂上正己醇氧化脱氢制正己醛 [J].催化学报,2005,26(5)::389～392.

[10] 王磊,程铁欣,周广栋.正己醇 (氧化)脱氢制正己醛的研究[J].分子催化,2003,17(6):434-438.

[11] 何建英,刘素环,陈丹红.己酸己醋的催化合成 [J].企业科技与发展,2007(17):47-48.

[12] 史清龙,樊明涛,闫梅梅,等.陕西主栽苹果品种间香气成分的气相色谱 /质谱分析[J].酿酒,2005,32(5):66-69.

[13] 王海波,陈学森,辛培刚,等.几个早熟苹果品种香气成分的 GC-MS分析[J].果树学报,2007,24(1):11-15.

[14] 张建军.苹果汁芳香物质的研究——传统蒸发、精馏工艺回收苹果汁中芳香物质[J].食品与发酵工业,1995,21(2):9-16.

[15] Rowan D D,Allen J M,Fielder S,et al.Biosynthesis of straight-chain ester volatiles in red dlicious and granny s mith apples using deuterium-labeled precursors[J].Agric Food Chem,1999,47:2 553-2 562.

[16] 孙爱东.苹果汁加工中典型芳香成分的形态、变化及香气调控的研究[D].山东:山东农业大学博士后学位论文,2002:9-16.

[17] Ki m I S,Grosch W.Partial purification of a lipoxygenase from apple[J].Agric Food Chem,1979,27:243-246.

[18] 史清龙,樊明涛,闫梅梅,等 .陕西主栽苹果品种间香气成分的气相色谱 /质谱分析 [J].酿酒,2005,32(5):66-69.

[19] 王海波,陈学森,辛培刚,等 .几个早熟苹果品种香气成分的 GC-MS分析[J].果树学报,2007,24(1):11-15.

[20] 田玉庭.源于澳洲青苹果的多酚氧化酶 (PPO)特性及阻氧抑制技术研究[D].陕西:西北农林科技大学硕士学位论文,2006:23-24.

[21] 王辉龙,孙永峰,陈淑玲,等.番茄果汁中脂肪氧化酶的分离纯化及β-过氧化物亚油酸的制备 [J].食品科学,2004,25(12):97-100.

[22] 郝慧英,赵光鳌,徐岩,等 .苹果中多酚氧化酶的性质[J].无锡轻工学报,2003,22(1):7-8.

[23] LaemmliU.K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:680-685.

[24] Krisztina Takács, éva Gelencsér,Elisabeth T,Kovács.Effect of transglutaminase on the quality of wheat-based pasta products[J].European Food Research and Technology,2008,226:603-611.

[25] 谢栋,彭憬,王津红.枯草芽孢杆菌抗菌蛋白 X9811Ⅰ的纯化与性质[J].微生物学报,1998,38(1):13-19.

[26] 令桢民,师俊玲,杨保伟.正己醇降解菌的分离、筛选及分类鉴定[J].菌物学报,2009,28(6):769-775.

[26] 杨玉芳.蛋白质含量测定方法[J].明胶科学与技术,2007,27(2):98-101.

[27] 陈惠,王红宁.在糖及硫酸铵对植酸酶热稳定性的影响[J].中国饲料,2004(18):22-23

[28] 李立祥,吴红梅.提取方法对茶多酚氧化酶活性的影响[J].生化 .检验中国茶叶加工,2001(4):26～31.

[29] D.R.马歇克等.蛋白质纯化与鉴定实验指南[M].北京:朱厚础,2002:13～16

[30] Pinsky A S,Gross man,Trop M.Lipoxygenase contenttand antioxidant activity of some fruit and vegetables[J].Food Chemistry,1971,36:571-572.

[31] 李大鹏.苹果醇酰基转移酶基因MdAAT2参与酯类香气合成调控机理的研究[D].山东:山东农业大学博士学位论文,2005.

[32] Sanz C,OliasJM,PerezA G.Aor ma biochemistryof fiuits and vegetables. Phytochemistry of Fruit and Vegetables.In F.A.Tomes-Barberan,RJ Robins,eds,PHytochermistry of fruits and vegetables[M].NewYork:Oxford University Press,1997:125-155.