梨果棒曲霉素产生菌的分离及ITS区鉴定*

谢芳超，刘春霖，杨相政，陈义伦

(山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安，271018)

棒曲霉素(patulin)，又称展青霉素，是一种非挥发性的内酯类化合物，会引发过敏症状［1］，引起免疫、神经系统和胃肠道毒性反应、突变和胚胎毒性［2－3］，在动物模型中还可造成DNA损伤，引起动物的胃肠道功能紊乱和不同器官的水肿和出血［4－5］。食品中棒曲霉素的残留问题已引起世界卫生组织的高度关注，对其最低限量做了严格规定(＜50 μg/L)，并有不断降低的趋势［6］。

目前，主要从两方面控制食品中棒曲霉素产生，一是提高对已经产生的棒曲霉素的去除能力，另一方面是针对棒曲霉素产生菌，通过控制菌株的生长产毒，从源头减少毒素的产生量。棒曲霉素已经在多种水果中检测出来［7－11］，产生棒曲霉素的菌主要来自污染水果的真菌青霉属(Penicillium)，曲霉属(Aspergillus)和丝衣霉属(Byssochlamys)［12］。梨果采后贮运过程易污染棒曲霉素产生菌，造成商品梨果及以梨浓缩汁为代表的梨加工产品棒曲霉素的污染，但污染梨果的棒曲霉素产生菌并不明确，同时缺乏实用的控制技术，本文以不同品种腐败梨果为材料，分离棒曲霉素产生菌并对其进行形态及ITS区鉴定，以期为控制梨果产棒曲霉素、提高梨加工品安全性提供基础理论和技术方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

莱阳仕梨、阳信鸭梨:采样于产地，自然腐败的梨果。

棒曲霉素标品(色谱纯):FERMENTEK Ltd.提供;甲醇(色谱纯)，其他试剂为分析纯。

1.2 培养基

(1)分离纯化培养基(PDA):马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 自然。

(2)菌种保藏培养基(CA):蔗糖3 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，NaNO30.3 g，KCl 0.05 g，FeSO40.001 g，琼脂 1.5 ～2 g，蒸馏水 100 mL。

(3)产毒培养基:现制莱阳梨梨汁(7.75 Brix，pH 4.27)，阳信梨梨汁(10.40 Brix，pH 4.37)。

1.3 仪器与设备

STI501型液相色谱仪，赛智科技(杭州)有限公司;TGC-18C型高速壹式离心机，上海安亭科技仪器厂;YSZ-H型电子显微镜，日本尼康公司。

1.4 棒曲霉素产生菌的分离纯化及棒曲霉素的检测

1.4.1 菌种分离与纯化

(1)菌种分离:取一定质量梨果的腐烂部位，匀浆，制成10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6g/mL 的稀释液，分别吸取200 μL进行PDA平板涂布，28℃倒置培养3～4 d。

(2)菌种纯化:当分离菌株在培养基上进入生长旺盛期时，挑取不同形态霉菌菌株的孢子，在PDA培养基上作平板划线纯化，28℃恒温条件下倒置培养。按此方法连续划线，直至单个平板上为形态单一的菌落。挑取平板上的单菌落进行纯培养，得到纯菌株。

(3)菌种保藏:将纯菌株接种于CA培养基中，4℃保藏。

1.4.2 产毒代谢培养

将分离得到的各个菌株进行平板纯培养，用静水压法制备106CFU/mL孢子悬浮液，1%(V/V)接种于产毒培养基中，28℃静置培养14天。

1.4.3 棒曲霉素HPLC检测

参照文献［13］对培养后的产毒培养基进行棒曲霉素HPLC检测。

1.5 棒曲霉素产生菌的鉴定

1.5.1 菌落形态及显微观察

参照文献［14］对培养7 d的棒曲霉素产生菌进行菌落形态和显微镜观察并记录。

1.5.2 棒曲霉素产生菌的分子鉴定

将棒曲霉素产生菌接种于液体CA培养基中，4～5 d后，真空滤干菌体，充分研磨后，用 OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01试剂盒进行DNA提取，之后用以下引物对菌株DNA进行ITS区 PCR扩增试验［15］:

PCR扩增的反应体系为50 μL，其中10×buffer 5 μL;dNTP 4 μL;引物各 4 μL;Taq 酶 0.5 μL;模板 4 μL;之后用双蒸水补足到50 μL。PCR扩增的反应条件为:94℃预变性 3 min，94℃变性 50s，50℃复性 1 min，72℃延伸1 min30s，进行35个循环，最后72℃终延伸10 min。

将PCR扩增产物送至华大测序公司进行测序，将测序结果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的GenBank进行Blast比对，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 棒曲霉素产生菌的确定

图1和图2分别为棒曲霉素标准品高效液相色谱图和P-1号样品色谱图。由图可知，棒曲霉素的保留时间为5.7 min。

从莱阳仕梨和阳信鸭梨腐烂果中，分离纯化得到了10株棒曲霉素产生菌，其代谢产物经HPLC检测均含有棒曲霉素，各菌株编号、代谢产物中棒曲霉素的含量和菌株来源见表1。由表1可知，10株菌产棒曲霉素的能力不同，其中P-1菌株产毒量最高，达2530.0 μg/L;P-10 菌株的产毒量最低，为 89.9 μg/L，但均超过了世界卫生组织对食品中棒曲霉素最低限量50 μg/L的要求。因此，所得到的10株菌均为梨果生产加工中严重危害食品安全的棒曲霉素产生菌。

图1 棒曲霉素标准品高效液相色谱图

图2 P-1样品检测图谱

表1 棒曲霉素产生菌产毒素含量

2.2 棒曲霉素产生菌形态学鉴定

图3为P-1菌株的菌落形态及显微结构的图片。棒曲霉素产生菌形态学鉴定结果见表2。经形态学初步鉴定，P-1，P-2，P-3，P-5，P-6，P-8，P-10 菌株为青霉属，P-4，P-7号菌株属曲霉属，P-9号菌株为镰刀属菌种。对分离的10株菌进行分子生物学分类鉴定，进一步确定其分类地位。

2.3 棒曲霉素产生菌分子鉴定

2.3.1 序列比对结果与分析

图3 P-1菌株的菌落形态

利用真菌试剂盒提取10株产毒素菌的DNA，PCR扩增后，将PCR产物送至北京华大基因进行测序，利用DNAMAN将测序结果进行拼接，拼接结果在Genank中进行Blast比对，得到同缘性最高菌，结果见表3。由表可知，P-1菌株Penicilliumsp.8-9，P-2菌株Penicillium purpurogenumstrain F43，P-3菌株Penicilliumsp.4382，P-5菌株Penicillumsp.3 TMS-2011 voucher BGd100p3-1，P-6菌株Penicillium funiculosumisolate NG_p14，P-8 菌株Penicillium polonicumstrain F5和P-10菌株Penicilliumsp.12-20为青霉属，P-4菌株Aspergillussp.CRCF11，P-7菌株Aspergillus versicolorstrain A11.2为曲霉属，P-9菌株Fusariumsp.NRRL44904为镰刀属菌种。

表2 棒曲霉素产生菌培养7天形态学主要特征

表3 菌株比对结果

2.3.2 系统发育树的构建

10株棒曲霉素产生菌的系统发育树结果见图4。

由此图4可知，10株菌从进化关系上分为两大类群，P-9 为一类群，P-1，P-2，P-3，P-4，P-5，P-6，P-7，P-8，P-10为另一类群。在另一类群中P-4与P-7，P-8在同一分支上，亲缘关系为84%;P-4和P-8为同一分支，亲缘关系 76%;P-1，P-2，P-3，P-5，P-6，P-10 在同一分支上，亲缘关系为96%。

3 小结

图4 10株棒曲霉素产生菌的系统发育树

(1)本次试验共筛选出莱阳仕梨及阳信鸭梨腐败梨果中棒曲霉素产生菌10株;对产生菌的形态及ITS区域进行了鉴定，结果表明:7株为青霉属，2株为曲霉属，1株为镰刀菌属;此10株菌的进化发育关系为:P-9为一类群，其他9株菌为一类群，其中P-4与 P-7，P-8 在同一分支上，P-1，P-2，P-3，P-5，P-6，P-10同在另一分支上。

(2)本次实验分离出的10株棒曲霉素产生菌中，青霉属菌与其他菌属相比为优势菌群，应用形态学和分子测序的方法初步确定了其菌群的生物学分类;筛选出产毒能力最强的P-1菌株可作为毒素控制的主要对象进一步研究。

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