牛乳清蛋白遗传多态性研究

曹喻，崔艳华，曲晓军，董爱军，马莺

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

牛乳清蛋白遗传多态性研究

曹喻1，崔艳华1，曲晓军2，董爱军1，马莺1

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

就牛乳清蛋白遗传多态性及其研究方法以及乳清蛋白多样性与乳品质之间的相关性作以阐述，旨在揭示当前该方向研究现状，并为今后研究提供参考。

乳清蛋白；遗传多态性；遗传变异体

0 引言

牛乳蛋白中主要包含两大类蛋白，即酪蛋白和乳清蛋白。其中，酪蛋白主要包括αS1-酪蛋白（αS1-CN）、αS2-酪蛋白（αS2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）及κ-酪蛋白（κ-CN）。乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白（β-LG）。这6种乳蛋白的总质量分数占牛乳总蛋白质量分数的90%。酪蛋白质量分数约占总蛋白的76%～78%，为牛乳中的主要成分。与酪蛋白相比，乳清蛋白质量分数较低，仅占总蛋白的12%～14%[1，2]。由于牛乳的组成（如乳脂率、乳蛋白质量分数与成分）以及牛乳的理化性状均与乳蛋白遗传多态性密切相关，因此近年来对于乳蛋白遗传多态性研究逐渐增多，但主要集中在酪蛋白方面，对乳清蛋白的研究相对较少[3]。本文就当前乳清蛋白多态性研究作以阐述。

1 牛乳清蛋白的遗传多态性

1.1 β-LG的遗传多态性

β-LG约占牛乳总蛋白的10%～15%[4]。β-LG由LGB基因编码[5，6]，定位于牛基因组的第11号染色体上（图1）[7]，为162个氨基酸组成的单链蛋白[8]。β-LG中含有5个二硫键，其中4个为链内二硫键，1个为链间二硫键[9]。目前，在不同来源的牛乳中已经发现的β-LG的变异体有11种，即变异体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和W（见表1）[10]。其中变异体B在不同来源的牛乳中出现频率最高，为β-LG的家族模式蛋白[10]，由162个氨基酸组成，其分子量为18277u。β-LG的信号肽由16个氨基酸组成，因此β-LG的前体为178个氨基酸。在目前的研究中，β-LG的变异体β-LG A、B、C、D、I、J、W具有精确测序数据，而β-LG H、E、F、G则没有精确的测序数据[11-14]。

图1 编码乳清蛋白β-LG（A）和α-LA（B）的基因的结构[7]

1.2 α-LA的遗传多态性

α-LA占牛乳中乳清蛋白质量分数的5%[15]。由LAA基因编码[5]，定位于牛基因组的第5号染色体上（图1）[7]。α-LA由123个氨基酸组成，为球状蛋白。α-LA的信号肽由19个氨基酸组成，因此α-LA的前体为142个氨基酸。目前，在不同来源的牛乳中已经发现的α-LA的变异体有3种，即变异体A、B和C（见表2）[10]。在不同来源的牛乳中出现频率较高的两种α-LA为变异体A和B。变异体A在大部分瘤牛品种中均存在，而在一些意大利及东欧黄牛品种中出现的频率则较低。变异体B为最常见，出现于大部分黄牛及瘤牛品种中[16]，为α-LA的家族模式蛋白[10]，其分子量为14178 u。α-LA的主要变异位点位于蛋白质第10个氨基酸处，变异体A所含有的氨基酸为Glu，变异体B含有的氨基酸则是Arg[17]。目前变异体A和B的序列已经被精确测得[18]，而变异体C的精确序列还没有测得[19]。学者研究表明，在牛乳中，α-LA不仅作为牛乳蛋白中的一部分存在，还对乳糖的生成及牛乳的分泌起到了调控作用[20，21]。

表1 牛乳β-LG遗传变异体的差异和分布[10]

表2 牛乳α-LA遗传变异体的差异和分布[10]

2 乳清蛋白遗传多态性研究的方法

自从对β-乳球蛋白的主要变异体鉴定以来，对牛奶中乳蛋白遗传多态性的研究已经开展了半个世纪[22]，而近年来遗传学、分子生物学等学科的快速发展则加速了其发展。对于牛乳蛋白遗传多态性的分析主要从蛋白质水平和核酸水平两方面进行，研究方法有很多，如电泳技术、等电聚焦技术、离子交换高效液相色谱、质谱以及PCR-SSCP和PCR-RFLP等等[2,23]。对蛋白遗传多态性的研究，常用的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳及以PCR为基础的相关技术，特别是PCR-RFLP技术，在近年来对蛋白遗传多态性的研究及对不同基因型的测定中，已经成为了重要分析手段[2,8]。以下将分别介绍从蛋白质水平及核酸水平对乳清蛋白遗传多态性进行研究时常用的方法。

2.1 蛋白质水平

2.1.1 蛋白质电泳

常规蛋白质电泳（protein electrophoresis）技术有酸性电泳、碱性电泳、双向电泳、等点聚焦、毛细管电泳、免疫印迹等，它们主要用于蛋白质水平的常规分型，只能检测出产生氨基酸替换或等电点变化等可导致电泳结果变化的遗传变异类型[2,23]。Lunden等人使用酸性和碱性PAGE电泳对瑞典红牛、白牛及荷斯坦牛进行αs1-CN、β-CN、κ-CN及β-LG的基因型测定，研究表明β-LG B等位基因对牛乳酪蛋白组成及酪蛋白占总蛋白比率呈现正向相加效应[24]。若蛋白质在核酸水平上发生了变异但此种变异未导致其编码的蛋白质发生变化，即在蛋白质水平上未发生变异，则称此种变异体为沉默变异体，常规蛋白质电泳无法对沉默变异体进行检测[2]。此种情况下，使用高效液相色谱技术（HPLC,high performance liquid chromatography）可以检测出沉默变异体[25]。

核酸水平上的检测则可以更深入的对导致乳蛋白遗传变异的原因作出分析，并且一些蛋白变异体在用于蛋白电泳的PAGE缓冲液中溶解效果较差[3]，因此在对乳蛋白进行研究时，可先对其进行表型水平上的分析，再进一步对其进行核酸水平上的分析。

2.1.2 等电聚焦电泳

等电聚焦电泳（IEF,isoelectric focusing electrophoresis）对于生物品种和种群在表型水平上的筛选最为有效，尤其在对于生物多态性的研究方面有很突出的效果。在对乳蛋白遗传多态性的研究中，利用IEF，对于一些珍稀动物，只需获得其乳样即可进行关于其蛋白遗传多态性的研究[23]。IEF快速、价格低廉，并且一次可以同时获取6种主要乳蛋白基因的表型表达数据，而DNA水平的检测仅能每次分析一种乳蛋白[26]。CAROLI等人使用IEF研究了αS1-CN、β-CN、κ-CN及β-LG的遗传多态性，对Reggiana黄牛、意大利黑白花牛、意大利褐牛的遗传分化进行了比较[27]。

2.2 核酸水平

核酸水平分析可独立于表型表达完成，并且不仅可以揭示编码区，还能够区分非编码区和侧翼区的差异[2]。目前对编码牛乳蛋白的基因核酸水平进行分析的方法已成熟，也是研究乳蛋白遗传多态性的常用方法，主要有PCR-RFLP、PCR-SSCP、直接测序、等位基因特异PCR和基因芯片等。由于PCR-RFLP与PCR-SSCP两种方法具有易于操作、对实验条件要求较低等特点，因此在乳蛋白研究中应用更为普遍[2]。对牛乳蛋白位点的遗传分型及DNA的PCR扩增技术可得到较精确的结果，且能在DNA水平上对乳蛋白基因型进行分析，从生物体内获得DNA的途径也多于获得乳蛋白的途径，因此在研究中应用广泛[28，29]。

2.2.1 PCR-RFLP分析

PCR-RFLP即聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术（Polymerase Chain Reaction and Restriction Fragment Length Polymorphism）。牛乳基因应用PCR进行扩增，再用特定限制性内切酶对所得片段进行切割，直接利用琼脂糖凝胶电泳检测，经分析可得到牛乳蛋白的不同基因型。Karimi等人使用PCRRFLP的方法得到伊朗Najdi牛的β-LG基因序列，并对其遗传多态性及与乳制品特性间的关系进行了分析[8]。

2.2.2 SSCP分析

PCR-SSCP即聚合酶链式反应-单链构象多态技术（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism）是在PCR的技术基础上发展起来的核酸水平分析技术。单链DNA段具有的复杂空间结构由其内部碱基配对等分子内相互作用力维持，当构成DNA的碱基发生改变时，单链DNA段的空间结构也会相应发生不同程度的改变，而这种微小的变化会导致此单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中运动时所受阻力发生改变，最终通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中迁移距离的不同体现出来。因此，PCR-SSCP技术可以敏锐的检测出目标乳蛋白基因片段中碱基具有的差异。Kaminski和Zabolewicz使用SSCP的方法，发现了β-LG 5'侧翼区位于-501与-293之间位置的6个变异体[30]。SSCP技术同样具有可以检测出沉默变异体的能力。Prinzenberg和Erhardt等人使用PCR-SSCP技术在黄牛与瘤牛的杂交品种中检测到一种κ-CN的沉默变异体，这种变异体后来被命名为κ-CNA(1)变异体[31]。

3 乳清蛋白遗传多态性对牛乳性状的影响

乳蛋白的组成在很大程度上影响着产乳量、乳成分、乳凝结性等指标。牛乳中乳蛋白的组成变化受很多因素的影响，如遗传因素、季节变化、牛的品种不同、泌乳阶段不同、牛的饲养及健康状况等等，其中，最主要的因素是遗传因素[5,31]。对于乳蛋白，遗传多态性指每种乳蛋白所具有两种或更多种的遗传形式，这些遗传形式是由常染色体和共显性等位基因决定的[32]。当牛体内负责编码产生相应乳蛋白的基因产生变化时，由此种基因编码生成的氨基酸发生了变化，相应的乳蛋白结构也产生了变化，导致了乳蛋白的遗传多态性，进而为牛乳带来不同的理化性状[1]。

研究乳蛋白遗传多态性主要有以下目的：（1）利用乳蛋白多态型基因频率估计不同品种间亲缘关系，研究品种的起源分化[33]；（2）研究基因、蛋白遗传多态性与牛产乳各项性能指标间关系，为育种提供理论依据；（3）研究蛋白遗传多态性对于乳品生产的影响，为实际生产提供理论依据[34]。

β-Lg是牛中发现最早和研究最多的乳蛋白基因[35]，与酪蛋白相比，乳清蛋白的蛋白遗传多态性通常较低，但众多研究也证明β-Lg的遗传多态性对于牛乳性状具有一定影响。这些影响主要体现在牛乳的组成、凝乳特性及热稳定性方面。相比之下对于α-LA遗传多态性对牛乳性状的影响的研究则较少。

3.1 乳的组成

β-LG遗传多态性对乳组成的影响主要体现在对乳的乳脂率的影响。研究者大多使用荷斯坦奶牛进行β-LG的相关研究，研究结果表明，β-LG B基因型与牛乳中的乳脂率及酪蛋白质量分数密切相关，而β-LG A基因型与乳清蛋白的增加有关[36，37]。乳的蛋白组成，在很大程度上决定了乳的营养价值和生产技术特性。

3.2 凝乳特性

在干酪的生产中，所采用的原料乳的凝乳特性对干酪的生产及产品质量有很大影响，通常具有较短凝聚并结块时间的原料乳生产得到的干酪质量较好[38]。研究表明，κ-CN对于乳的凝乳特性具有较大影响，但其他乳蛋白尤其是β-CN和β-LG，与κ-CN的相互作用必须充分考虑。含有BB型β-LG的乳通常具有较高的脂肪质量分数、蛋白、酪蛋白和固形物质量分数，能缩短凝乳时间，加固奶酪凝乳的密度，提高奶酪的产量，在生产中更利于凝乳，适合干酪的加工[37,39，40]。

干酪生产中的凝乳时间和凝块硬度等特性依赖于乳中酪蛋白的组成。增加酪蛋白质量分数，有助于提高干酪产量[37]。对β-LG蛋白大多数研究表明β-LG BB基因型可导致牛乳中酪蛋白质量分数，因此通常含有β-LG BB基因型的牛乳具有较高的理论干酪产量，且干酪终产量与β-LG BB在牛乳中质量分数成正比[36，37]。Heck等人对荷斯坦奶牛进行研究，发现与A型变异体相比，基因型为β-LG BB的牛乳中，尽管β-LG质量分数较低，但乳中α-LA、αS1-CN、αS2-CN、β-CN及κ-CN的质量分数相对较高，这一特点非常利于干酪生产[1]。

3.3 热稳定性

在牛乳的加工过程中，高温工序如预热、巴氏杀菌、超高温灭菌等常常是不可避免的。这些工序往往会导致乳中蛋白质高温变性，乳的性状也随之发生变化。不同生产中对乳的热稳定性要求不同。Imafidon等人研究表明，β-LG不同变异体的热稳定存在差异，同时其热稳定性受乳中的κ-CN变异体类型及CaCl2影响。β-LG BB型的热稳定性高于其他类型变异体。κ-CN AA型提高乳热稳定性，而κ-CN BB和AB型则降低热稳定性。β-LG BB或AB与κ-CN AA的组合可以使乳的热稳定性最大，而β-LG AA与κ-CN AA，以及β-LG AA与κ-CN BB组合的热稳定性低[41]。

4 结束语

乳清蛋白α-LA和β-LG的蛋白多态性与乳制品（奶酪等）实际生产性能密切相关，因此乳清蛋白遗传多态性研究具有理论价值的同时，具有重要的应用价值。目前对乳清蛋白多态性的研究多采用传统方法，因此发展新型的、简便快捷的分析方法具有很大的价值。牛乳中乳清蛋白多态性研究，将为牛品种选育提供参考，进而达到调整牛乳中乳蛋白成分，改善牛乳生产性能的目的；并为物种起源分化提供宝贵资料，因此具有较大发展空间。

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Whey protein polymorphisms in cattle milk

CAO Yu1,CUI Yan-hua1，QU Xiao-jun2,DONG Ai-jun1,MA Ying1
(1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Microbiology,Heilongjiang Science Academy,Harbin 150010,China)

In this paper,whey protein polymorphism,its research methods and the correlation between whey protein polymorphism and milk quality were reviewed.The aim of this paper is to illustrate the current research status of whey protein polymorphism and to provide reference for future researches.

whey protein;genetic polymorphism;genetic variant

Q933

B

1001-2230（2011）05-0043-04

2011-030-28

国家自然科学基金资助项目（30871953，31071571）。

曹喻（1989-），女，本科，研究方向为为牛乳蛋白多样性。

马莺