MLSA用于双歧杆菌快速鉴定研究进展

赵婷，程池

(中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027)

MLSA用于双歧杆菌快速鉴定研究进展

赵婷，程池

(中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027)

通过对16S rRNA，hsp60，rpoB，atpD，tuf基因部分序列的分子系统发育学分析，综述多位点序列分析技术（MLSA）用于双歧杆菌快速鉴定的研究进展。

MLSA；双歧杆菌；基因；鉴定

0 引言

双歧杆菌是一类革兰氏阳性，细胞形态多变，严格厌氧的细菌，被作为益生菌广泛应用于食品，特别是乳品及婴幼儿食品中[1]。卫生部2010年65号文《可用于食品的菌种名单》中，包含双歧杆菌属的7个种及亚种，因此，规范食品行业菌种的管理和评价程序，建立准确、快速的双歧杆菌鉴定体系非常重要。

16S rRNA基因序列分析是分类的重要组成部分，但对亲缘关系比较近的种分辨率不高，相比16S rRNA基因的高度保守性，看家基因具有更高的分化程度，多位点序列分析（Multilocus Sequence Analysis，MLSA）利用多个基因信息之间的相互比较，综合分析，可以得到一个比较全面可信的物种间的关系，更适用于菌种的分类鉴定[2]。目前，用于双歧杆菌系统发育分析的看家基因有hsp60，rpoB，atpD，groEL，tuf等。

1 双歧杆菌属的分类演变

双歧杆菌（Bifidobacterium）是1899年由Tissier从母乳营养婴儿的粪便中分离得到，1924年Orla-Jensen对其进行了修订，因其细胞末端常常分叉，故名双歧杆菌。1929年Pribram提出的“Tissieria”，1938年Prevot提出的“Bifidibacterium”被认为是“Bifidobacterium”的同义词。双歧杆菌（Bifidobacterium）包含在1980年SKERMAN等发表的生效细菌名称名录（Aprroved List of Bacterial Names）中[3]，目前，该属包含36个种，9个亚种，模式种为两歧双歧杆菌（B.bifidum）[4]。

微生物分类是不断发展变化的动态过程，尤其是在最近30多年，随着分子生物学技术的发展，双歧杆菌属内一些种也发生了变迁或者新种的加入，如：2004年，Liesbeth等[5]根据DNA-DNA杂交、扩增片段长度多态性（AFLP）、atpD及groEL基因序列分析等将乳双歧杆菌（B.lactis）重新划分为动物双歧杆菌乳亚种（B.animalissubsp.lactis）；2002年Sakata等[6]根据16S rRNA，hsp60，16S-23S ITS基因序列分析及DNADNA杂交数据曾将婴儿双歧杆菌（B.infantis）、猪双歧杆菌（B.suis）合并进长双歧杆菌（B.longum），统一3个种为长双歧杆菌（B.longum）；2008年，Mattarelli等[7]根据DNADNA杂交、16S rRNA基因序列及hsp60基因序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等数据，将长双歧杆菌（B.longum）重新划分为3个亚种：长双歧杆菌长亚种（B.longumsubsp.longum）、长双歧杆菌婴儿亚种（B.longumsubsp.infantis）、长双歧杆菌猪亚种(B.longumsubsp.suis)。2010年，Jiri等[8]发表了双歧杆菌属的两个新种B.actinocoloniiforme和B.bohemicum，同年，Min-Soo等[10]发表了双歧杆菌属的一个新种B.stercoris[9]，Hidetoshi等发表了双歧杆菌属的一个新种B.kashiwanohense。

2 16S rRNA基因序列分析

Stackebrandt等[11]经过大量数据分析后提出了种水平的判别标准，同种的16S rRNA基因序列同源性应大于97%。围绕《可用于食品生产的菌种名单》中列出的双歧杆菌属菌种（图1中下划线所示），从GenBank获得部分种及亚种模式株的16S rRNA基因序列，选取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NBRC 13719T作为外群，采用MEGA4.1软件Kimura模型，邻位连接法，进行1000次相似度重复计算并构建系统发育树（见图1），结果表明：通过16S rRNA基因序列分析，菌株B.longumsubsp.longum、B.longumsubsp.suis、B.longumsubsp.infantis、B.breve聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.6%～99.7%；菌株B.animalissubsp.animalis，B.animalissubsp.lactis，B.choerinum，B.pseudolongum聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.1%～99.3%；菌株B.adolescentis，B. stercoris，B.ruminantium，B.dentium聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.5%～99.4%；B.bifidum单独形成一个分支，且与属内其他种同源性均小于97.0%。

3 双歧杆菌属的多位点序列分析（MLSA）

围绕《可用于食品生产的菌种名单》中列出的双歧杆菌属菌种（图2～图5中下划线所示），根据现行分类体系，从GenBank获得部分种及亚种模式株的hsp60，rpoB，atpD，tuf基因部分序列，hsp60基因编码热休克蛋白（heat-shock protein），rpoB基因编码RNA聚合酶β亚单位（RNA polymerase β-subunit gene），atpD基因编码ATP合成酶F1部分的β亚单位（ATP synthase F1 beta subunit），groEL基因编码groEL蛋白（groEL protein），tuf基因编码延伸因子Tu（elongation factor Tu），选取Escherichia coli K-12作为外群，采用MEGA4.1软件Kimura模型，邻位连接法，进行1000次相似度重复计算并构建系统发育树，groEL基因因提交的有效序列较少，未构建系统发育树。部分双歧杆菌参考菌株如表1所示；用于分析的看家基因PCR引物如表2所示。

hsp60基因序列分析表明（图2）：菌株B.longum subsp.longum，B.longumsubsp.suis，B.longumsubsp.infantis聚 类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性分别为98.4%，98.8%，98.4%，与属内其他种序列同源性均小于94.7%；菌株B.animalissubsp.animalis和B. animalissubsp.lactis聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.6%，与属内其他种序列同源性均小于85.7%；菌株B.breve单独形成一个分支，且与属内其他种序列同源性均小于94.7%；菌株B.adolescentis单独形成一个分支，且与属内其他种序列同源性均小于92.6%；B.bifidum单独形成一个分支，且与属内其他种同源性均小于92.5%。

rpoB基因序列分析表明（图3）：菌株B.longumsubsp.longum和B.longumsubsp.infantis聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为98.1%，与属内其他种序列同源性均小于95.6%；菌株B.animalissubsp.animalis和B.animalissubsp.lactis聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.5%，与属内其他种序列同源性均小于94.3%；菌株B.breve与属内其他种序列同源性均小于95.0%；菌株B.adolescentis和B.pseudocatenulatum聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.5%，与属内其他种序列同源性均小于96.9%；B.bifidum与属内其他种序列同源性均小于96.3%。

表1 本文涉及的部分双歧杆菌参考菌株

表2 用于分析的看家基因PCR引物

atpD基因序列分析表明（图4）：菌株B.longumsubsp.longum，B.longumsubsp.suis，B.longumsubsp.infantis聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性分别为98.7%，97.1%，96.9%，与属内其他种序列同源性均小于95.6%；菌株B.animalissubsp.animalis和B.animalissubsp.lactis聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.2%，与属内其他种序列同源性均小于94.1%；菌株B.breve与属内其他种序列同源性均小于95.6%；菌株B. adolescentis与属内其他种序列同源性均小于92.8%；B.bifidum与属内其他种序列同源性均小于94.1%。

tuf基因序列分析表明（图5）：菌株B.longumsubsp.longum，B.longumsubsp.infantis，B.bifidum聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性分别为96.4%、94.0%、93.0%；菌株B.animalissubsp.animalis，B.animalissubsp.lactis，B.breve，B.magum，B.cuniculi聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性分别为96.4%，93.7%，94.3%，92.8%；菌株B.adolescentis和B.ruminantium聚类在进化关系最近的一个分支上，且种间序列同源性为97.6%。

16S rRNA，hsp60，rpoB，atpD，tuf基因序列系统发育树具有基本一致的拓扑结构，在鉴定分辨率上，看家基因hsp60，rpoB，atpD，tuf明显优于16S rRNA基因，《可用于食品生产的菌种名单》列出的双歧杆菌中除长双歧杆菌2个亚种的区分度较低外，其余均可通过单个或多个看家基因进行区分。

长双歧杆菌（B.longum）亚种间的区分相对比较困难，长双歧杆菌婴儿亚种（B.longumsubsp.infantis）、长双歧杆菌长亚种（B.longumsubsp.longum）2个亚种的区分需要借助于表型特征、RAPD、DGGE、核糖体分型（ribotyping）等鉴定技术手段[7]。2002年，Sakata等[6]进行了RAPD分析，结果显示长双歧杆菌（B.longum）3个亚种形成有差异的电泳图谱。2002年，Requena等[12]报道了长双歧杆菌（B.longum）3个亚种形成有差异的DGGE带型。2006年，Sakata等[13]通过ribotyping分析，发现长双歧杆菌（B.longum）3个亚种形成不同的簇或者亚簇。长双歧杆菌（B.longum）3个亚种的糖发酵特征数据如表3所示[7]。

表3 长双歧杆菌（B.longum）3个亚种的糖发酵特征数据

4 国内外研究状况

MLSA利用不同基因组位点的保守基因确定细菌的分类地位，具有快速、准确、可操作性强等特点，是细菌分类发展的一个方向。Naser等[15]采用MLSA对已知的肠球菌(Enterococcus)进行了鉴定，结果表明，这种鉴定方法能将16S rRNA基因序列无法分辨的乳酸菌区分开来[14]。Naser等应用基于pheS和rpoA基因的MLSA等技术，将Lactobacillus amylophilusLMG 11400和NRRL B-4435重新分类为Lactobacillus amylotrophicus。McTaggart等[16]利用gyrB，16S rRNA，secA1，hsp65，rpoB5个基因位点序列分析，认为MLSA对诺卡氏菌的鉴定比形态观察、生理生化试验、脂肪酸分析等具有更高的分辨率。Byoung等[17]评估了rpoB基因对于双歧杆菌的分辨率，rpoB基因序列相似度为84.1%～99.0%，可以作为双歧杆菌鉴定的有效分子标签，并得到了其他分子鉴定工具的支持。蹇文婴等[18]报道了利用hsp60基因对双歧杆菌进行鉴定的方法，认为高度保守和普遍存在的hsp60基因是用于双歧杆菌鉴定更精准的分子标签。Ventura等[19]分析了乳杆菌属和双歧杆菌属tuf基因的特征及位点，认为tuf基因可替代16S rRNA用于双歧杆菌鉴定；Sheu等[20]采用基于tuf基因设计的引物实现对双歧杆菌益生菌部分种的PCR检测。值得指出的是，当时用于研究的部分菌种其分类学地位已经发生变迁。

相比16S rRNA基因的高度保守性，具有更高碱基置换率的看家基因更适用于细菌分类，Zeigler认为[21]经过精心筛选的少数看家基因序列的精确度等同于甚至优越于DNA同源性分析。Richter等[22]通过对大量细菌全基因组序列的分析，提出了部分或全部基因组序列ANI（Average Nucleotide Identity）分析作为细菌分类的金标准，代替传统的DNA杂交分析，随着测序技术的不断发展，更严谨准确的ANI技术用于细菌分类也成为可能。

5 结束语

本文对《可用于食品的菌种名单》中双歧杆菌的MLSA快速鉴定方法进行了总结，期望为食品行业企业的菌种使用提供技术依据。在乳品企业的实际生产中，涉及属于普通食品原料、长期食用安全、且普遍应用的微生物菌种远不止《可用于食品的菌种名单》所列21种，国际乳业联盟（IDF）《具有在食品中使用记录史的微生物清单》IDF377中包含110种，其中增加的双歧杆菌属菌种为假长双歧杆菌（Bifidobacterium pseudolongum），欧洲食品安全局（EFSA）安全资格认定（QPS）的微生物名单中包含74种，《可用于食品的菌种名单》中以“传统上用于食品生产加工的菌种允许继续使用”对此进行了解释。

除MLSA外，基于生理生化代谢特征的API 20 A厌氧菌鉴定试剂条，可鉴定青春双歧杆菌（B.adolescentis）、两歧双歧杆菌（B.bifidum）、短双歧杆菌（B.breve）3个种，同时，传统的形态学特征观察也是必要的。另外，《可用于食品的菌种名单》中的婴儿双歧杆菌（B. infantis）、乳双歧杆菌（B.lactis）、乳酸乳球菌双乙酰亚种（L.lactis subsp.diacetylactis）未采用最新分类学名称，笔者认为应根据最新的分类学研究给出规范的分类学名称，同时可以保留长期沿用的通俗名称，以体现先进性和科学性。

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Research progress of multilocus sequence analysis(MLSA)for rapid identification of Bifidobacterium species

ZHAO Ting，CHENG Chi
(China National Research Institute of Food&Fermentation Industries,China Center of Industrial Culture Collection, Beijing 100027,China)

This paper reviewed and evaluted the use of 16S rRNA，hsp60，rpoB，atpD，tufgene part sequences as species identification tools forBifidobacterium,Strain sequences were derived from GenBank datebase,Phylogenetic analysis showed that the multilocus sequence analysis(MLSA)approach toBifidobacteriumtaxonomy was possible,and the discriminary of MLSA was higher than 16S rRNA.

MLSA；Bifidobacterium；gene；Identification

Q93-331

B

1001-2230（2011）06-0046-05

2011-03-31

国家科技支撑计划项目(No.2007BAK36B06)。

赵婷（1980-），女，硕士，从事微生物系统分类学研究。

程池