几株益生乳杆菌耐药性的研究

梁萌萌,张柏林,赵紫华,韩俊华

(1.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018;2.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)

几株益生乳杆菌耐药性的研究

梁萌萌1,张柏林2,赵紫华1,韩俊华1

(1.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018;2.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)

采用药敏纸片法研究了戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌等7株益生乳杆菌对11种抗生素的敏感性,结果发现,7株乳杆菌均耐受多种抗生素。对戊糖乳杆菌LP-B耐四环素基因(tetM,tetS和tetW)的初步研究表明,该四环素耐受基因不位于基因组DNA上,是否存在于质粒上及其该基因的转移性等尚有待于进一步研究。

益生菌;乳杆菌;耐药性

乳酸菌是一大类能发酵葡萄糖(或其他可利用的碳水化合物)产生乳酸的细菌。它们大多是来源于人或动物肠道的正常菌群,包括乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌等多个菌属,是迄今为止广泛使用的一类益生菌,在医药保健、食品、饲料等各个领域发挥了重要作用。

传统的乳酸菌菌种,如嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在安全应用上已有很长的历史,被认为是没有致病可能性的微生物。目前新的益生乳酸菌菌种不断被开发出来进入市场,这些新菌种是否具有传统菌种的安全性,已引起国内外专家的极大争论。所以,重新评价它们的安全性是十分必要的。乳酸菌等益生菌的耐药性评价是益生菌安全评价的一项重要内容。有研究表明,用于生产酸奶、保健品的乳杆菌、双歧杆菌和链球菌等具有耐药性且携带耐药基因[1-2]。一般认为,如果没有抗生素的广泛使用等选择性压力的存在,对益生菌传递耐药性的忧虑是没有必要的。但当抗生素滥用已成为一种严重的社会问题时,监测益生菌的耐药性就显得非常必要和迫切了。

近十年来,国外在益生菌的耐药性方面做了大量研究工作。D’AIMMO等较系统地报道了双歧杆菌、乳杆菌、片球菌等对卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及与抗性有关的基因,如Bif idobacterium longum抗四环素(tetracycline)的基因tetW,干酪乳杆菌(L actobacillus casei)抗四环素和红霉素(erythromycin)的质粒基因tetM和ermB等[1]。TOOMEY等则进一步研究报道了戊糖乳杆菌(L actobacillus plantarum)的抗四环素基因tetM在菌株间的转移[3]。这种抗药基因在菌种间的转移对于人类将是很大的威胁。

目前中国还少见由益生菌引起人体感染和患病的报道,也缺乏益生菌耐药性及人群使用后的流行病学调查资料。中国对益生菌耐药性的研究只局限在表观分析上,尚没有对耐药基因的系统研究报道。

本研究将对分离自食品、保健品中的几株益生乳杆菌进行耐药性分析,了解菌株的耐药性,为进一步系统研究益生菌的耐药性及安全性提供有价值的资料,也将有助于促进益生菌安全性评价方法和安全性评价体系的建立,促进中国益生菌市场的健康发展,使益生菌更好地为人们的健康服务。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

实验所用菌种如下,1)戊糖乳杆菌:Ind-1,Ind-3,LP-B,P;2)干酪乳杆菌:D-400;3)瑞士乳杆菌:L H-9,LLB。以上菌种来自北京林业大学食品科学系,均为冷冻干燥菌种。

所用培养基如下:脱脂乳培养基(每100 mL分别加入脱脂奶粉14.0 g、葡萄糖1.5 g、酵母膏0.5 g)、MRS液体培养基、MRS琼脂培养基。

1.2 药敏纸片

抗生素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司,每片直径为 6.5 mm;哌拉西林(100μg/片),庆大霉素(10μg/片),红霉素(15μg/片),四环素(30μg/片),万古霉素 (30μg/片),氯霉素(30μg/片),青霉素G(10IU/片),环丙沙星(5μg/片),头孢噻吩(30μg/片),链霉素(10μg/片),利福平(5μg/片);质量完全符合 WHO标准规定。

1.3 仪器和试剂

仪器:血球计数板、XPX-250B-Ⅱ生化培养箱、洁净工作台、分析天平、显微镜、高压灭菌锅等。

试剂:无水乙醇、氯化钠、酵母膏、脱脂奶粉等。

1.4 菌种活化

将一定量的冷冻干燥菌种在灭菌的0.85%(质量分数)的生理盐水中复水,在脱脂乳培养基和MRS液体培养基中逐级活化,待活力恢复后,再以1%(体积分数)接种量接种至MRS液体培养基,于37℃恒温培养10 h,作为试验菌种备用。

1.5 药敏纸片法测定菌种耐药性

1.5.1 接种、药敏纸片贴放及培养

吸取试验菌菌液1 mL(约1.5×108cfu/mL)于直径90 mm灭菌培养皿中,倾倒约15 mL的MRS琼脂培养基,混匀,待培养基凝固后,在室温下干燥5 min。用无菌镊子将药敏纸片紧贴于琼脂表面,各纸片中心相距大于24 mm,纸片距平板内缘大于15 mm,每皿贴放3片。室温放置1.5 h,然后置于37℃培养,24 h后用精确度1 mm的游标卡尺测量并记录抑菌圈直径。每种抗生素均设3个重复,结果取平均值。

以标准敏感菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923(Staphylococcus aureusATCC 25923)为质控菌 ,操作同上。

1.5.2 受试菌对抗生素的敏感性判断

受试菌株对多种抗生素的药敏性参照 WHO提供的NCCLS最新标准(见表1)进行判断,报告该受试菌对该抗生素是敏感(susceptible,用S表示),耐药(resistant,用R表示),还是中度敏感(intermediate,用 I表示)。

表1 试验用药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准Tab.1 Antibiotic susceptibility test discs and criterion for inhibitory result

1.6 抗药基因的检测

乳杆菌基因组DNA的提取参照 GIRAFFA等人的方法[4]进行。

以tetM,tetS和tetW为引物,通过PCR基因扩增检测戊糖乳杆菌LP-B对四环素的抗药性。引物由北京华大基因公司合成,其序列及相关 信息见表2。

表2 检测四环素抗性基因的引物Tab.2 Primers used for PCR detection of tetracycline resistance genes

以戊糖乳杆菌LP-B的基因组DNA为模板,PCR反应条件如下:94℃预变性3 min,94℃变性1 min,52～54℃退火30～60 s,72℃延伸1 min,共30个循环,72℃延伸10 min[7]。反应结束后取1.0%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳(100 V,4℃),经染色,紫外灯下观察并照相记录。

2 结果与分析

2.1 乳杆菌的耐药性

将贴放药敏纸片后培养24 h的培养皿取出,测量各培养皿中药敏纸片产生的抑菌圈的大小。结合表1的判断标准得出药敏性结果,见表3。

表3 7种受试菌对11种抗生素的药敏性试验结果Tab.3 Antibiotic resistance results for 7 strains tested with 11 antibiotics

由表3可见,4株戊糖乳杆菌有相似的耐药谱,只是对于哌拉西林、头孢噻吩、氯霉素、四环素、利福平有差异。Ind-3对上述4种抗生素有耐药性,其他3株菌没有耐药性。

2株瑞士乳杆菌的耐药谱也相似,但是L H-9对四环素中度敏感而LLB对其有耐药性。由以上结果可以看出同一属的不同菌株的抗药性也是有差异的。

所有菌株对青霉素 G、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、万古霉素耐药,对红霉素都不耐药。对于哌拉西林、头孢噻吩和氯霉素,除Ind-3耐药外其他都不耐药。L H-9,LLB和 Ind-3对利福平耐药,其他不耐药。对于四环素,除 P,LP-B,D-400和L H-9菌株外均耐药。具有这样耐药性的乳酸菌进入人体是潜在的不安全因素。可见,建立并加强中国益生菌的耐药性监测体系,评估目前所使用的菌种的安全性,促进食品和保健品市场的健康发展是极为必要和迫切的。

2.2 乳杆菌耐药基因的探讨

提取戊糖乳杆菌LP-B基因组 DNA后,以tetM,tetS和tetW为引物,通过 PCR扩增检测其四环素耐药基因,结果如图1所示。

由图1可见,扩增出的条带和表2中报道的大小不符。因此,初步认为,戊糖乳杆菌LP-B的基因组上不存在四环素抗性基因tetM,tetS和tetW。然而由于该菌株表现出对四环素的抗性,因此抗性基因很可能存在于质粒上,尚有待于后续研究。

图1 戊糖乳杆菌LP-B基因组DNA的PCR结果Fig.1 PCR result of genomic DNA in L actobacillus pentosusLP-B

3 结 语

全球性的细菌抗生素耐药是近年来感染性疾病治疗所面临的一大难题。随着各种新型抗生素在临床上的应用,细菌的耐药也越来越广。目前,国际上对益生菌耐药性的测定尚缺乏标准程序。笔者参考WHO方法,选择了抑制细菌细胞壁、蛋白质合成的11种常用抗生素。被检测的7株益生菌均耐受3种以上的抗生素,属于多重耐药菌。而益生菌对人体健康影响的一个非常重要的方面就是其耐药性,其中万古霉素尤其受到关注。万古霉素在临床上通常被推荐用来治疗对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌的感染,包括败血症、心内膜炎、组织和骨感染,通常被认为是抗菌药物的最后一道防线[8]。许多乳杆菌,如罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌均具有对万古霉素的耐药性,被认为是一种天然特性[9]。本研究测定的7株益生菌均表现出对万古霉素的耐药性。这些研究结果提醒人们,在将益生菌应用于食品中时应该谨慎,避免选用有耐药性的菌种,同时在临床上则应该选用敏感性药物。

明确乳酸菌的耐药机制是十分重要的。研究发现,罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌中存在R质粒,它携带红霉素、氯霉素、大环内酯类林克霉素等的耐药基因。大量与耐药相关的基因都位于质粒和转座子这些可转移性遗传物质上[10]。本研究结果表明,与戊糖乳杆菌LP-B四环素耐药性相关的tetM,tetS和tetW基因不在基因组DNA上,很可能存在于质粒上。因此,进一步研究其耐药基因及其转移性是非常必要的。而且,目前益生菌的安全性问题主要集中在由益生菌所携带耐药基因转移引起的耐药性上。可见,益生菌菌株的耐药性评价是目前国际上益生菌安全评价的首要内容。

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Study on antibiotic resistance of probiotic lactobacillus

LIANG Meng-meng1,ZHANGBo-lin2,ZHAO Zi-hua1,HAN Jun-hua1
(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang Hebei 050018,China;2.College of Bioscience and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

In this study,the antibiotic sensitivity of probiotic lactobacillus(L actobacillus pentosus,L actobacillus helveticusandL actobacillus casei)to 11 kinds of antibiotics is tested by antibiotic susceptibility test discs.The results show that each strain is resistant to more than 3 kinds of antibiotics.The tetM,tetS and tetW genes related to tetracycline resistance ofL actobacillus pentosusLP-B are discussed.However,the genes are not found in the genomic DNA ofL actobacillus pentosusLP-B.So the characterisation and transferability of antibiotic resistance genes is yet to be studied.

probiotics;lactobacillus;antibiotic resistance

TS201.3

A

1008-1534(2011)04-0250-04

2011-02-22;

2011-03-29

责任编辑:王海云

河北科技大学2010年度大学生科技创新基金资助项目(10259);河北省高等学校科学技术研究青年基金资助项目(2010240);河北科技大学博士科研基金资助项目(000335)

梁萌萌(1987-),女,河北沧州人,主要从事食品微生物及生物技术方面的研究。

韩俊华博士。E-mail:teach2003@126.com