苏云金芽孢杆菌晶体蛋白分离纯化新方法研究

杨开杰

(邢台广播电视大学理工系,河北邢台 054000)

苏云金芽孢杆菌晶体蛋白分离纯化新方法研究

杨开杰

(邢台广播电视大学理工系,河北邢台 054000)

分离苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体蛋白常用的方法有液体双相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分离法等,但这几种方法各有优缺点。从分离成本、仪器设备、纯度、产量、活性等方面考虑,在超声波处理、悬液制备和紫外线辐射3个方面进行了改进,提出了一种新的分离Bt晶体蛋白的方法,产品纯度可达90%以上,产率从原来的20%提高到28%。本方法成本低,产率高,操作简单,具有很强的实用价值。

苏云金芽孢杆菌;分离纯化;晶体蛋白

苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis,Bt)是一种绿色生物农药,属于微生物杀虫剂,其有效杀虫成分是伴孢晶体和芽孢。由于Bt具有对病虫害防治效果好、对人畜安全无毒、不污染环境、不杀害天敌等优良品质而倍受青睐,全世界年产值已突破1亿美元,并且以每年10%～20%的速度上升[1]。为了更深刻地了解Bt农药的杀虫机理及其基因表达,从Bt中分离纯化有效成分伴孢晶体则十分重要[2]。目前常用的分离纯化方法有双相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分离法,这些方法在晶体蛋白的质量和产量、实验的重复性等方面各有优缺点。常用的四氯化碳-硫酸钠双相法尽管产量比较高,所用试剂价廉,仪器简单,但纯度不够,试剂毒性比较大,操作不方便。密度梯度法常用的是泛影葡胺梯度离心法,能获得纯度较高的晶体,但产量较低,试剂及实验条件要求比较严格。沉淀法试剂便宜,产品纯度高,但操作繁琐,产率低。生物-物理分离法试剂昂贵,实验条件苛刻,产率低[3]。在前人工作的基础上,笔者对超声波处理条件、离心条件、试剂选择等方面进行了改进,建立了一种新的Bt伴孢晶体分离纯化方法,收到了比较理想的效果。

1 材料、设备与方法

1.1 材料和设备

材料:Bt,中国科学院生态环境研究中心提供;牛肉膏,胰蛋白胨,酵母膏,葡萄糖,琼脂,磷酸氢二钠,北京双旋微生物培养基制品厂提供;聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),中国医药(集团)上海化学试剂公司提供;溴化钠,天津化学试剂三厂提供;小菜蛾,购自中国科学院动物所,在培养箱中于25℃养育繁殖。

主要设备:数显光照培养箱,磁力搅拌器,座式电热压力蒸汽消毒器,SW-CJ-FD型净化工作台,YS2-H生物显微镜,SIGMA离心机,J Y92型超声波细胞粉碎机,L GJ台式冷冻干燥机。

1.2 方 法

1.2.1 菌体的固体培养

牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成如下:牛肉膏3 g,蛋白胨 10 g,氯化钠 5 g,琼脂 15～20 g,去离子水1 000 mL,pH值为7.4～7.6。使用此培养基,进行斜面活化接种,在培养箱中于37℃固体培养24 h获得Bt菌株。

1.2.2 菌体的液体培养

液体种子培养基的组成如下:胰蛋白胨质量分数为0.5%,酵母膏质量分数为0.5%,葡萄糖质量分数为0.1%,磷酸氢二钠质量分数为0.08%,去离子水500 mL。灭菌前用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值为7.0。将固体培养基所得到的Bt菌株用无菌水制成一级种子,接种到液体种子培养基中,在恒温光照培养箱中以250 r/min的转速于30℃培养16 h,获得Bt发酵液。

1.2.3 晶体的提纯与分离

将培养成熟的Bt发酵液用磁力搅拌器搅拌。孢子的密度较小,大部分进入泡沫,而蛋白晶体处于水层。除去泡沫,使孢子和晶体得到初步分离,再经多次重复以尽量除去孢子。然后用超声波处理,使芽孢、晶体以及碎片在水中均匀分散。在4℃冰箱内放置24 h,使芽孢和伴孢晶体充分游离。于7 000 r/min的转速下离心15 min,弃去上层清液。加蒸馏水制成悬浮液,离心洗涤3次,然后用0.5 mol/L的NaCl溶液洗涤2次,收集沉淀物。将得到的沉淀物用生理盐水制成孢晶悬液,放入4℃冰箱备用,每次制成水悬液都经超声波处理。

将孢晶悬液离心分离,使沉淀悬浮于0.4 mol/L的NaCl+质量分数为0.01%的 Triton X-100(二者体积比为1︰1)的溶液中,在4℃的冰箱里静置过夜。离心分离,收集沉淀物,制成水悬液。配制浓度不同(2.8,3.2,3.6 mol/L)的溴化钠溶液,将水悬液放在溴化钠溶液中,于7 000 r/min的转速下离心分离15 min即在2.8 mol/L和3.6 mol/L的界面处得到伴孢晶体层,用弯头注射器沿壁插入,收集含有晶体的溴化钠溶液。将得到的溴化钠溶液于7 000 r/min的转速下离心分离10 min,收集晶体沉淀,用蒸馏水洗涤沉淀3～4次,配制成晶体水悬液,并置入冰箱冷冻过夜后,放入冷冻干燥机中干燥,得到白色的晶体蛋白。用此方法获得的晶体纯度可达99%以上,产率为28%。

2 结果与讨论

2.1 超声波条件的选择

为了将Bt的孢子囊和伴孢晶体分离开,通常使用的手段是进行超声波处理,文献中介绍的一般方法是间隔时间为0.1 s,超声时间为1 s,超声次数为50次,目测分离效果。超声时间过短,分离效果差;超声时间过长,容易破坏伴孢晶体。为了更准确选定超声条件,使用显微镜代替人眼进行观察。发现在上述条件下仍有部分孢子囊和伴孢晶体没有分开,超声强度还有加大的空间。因此,调整了超声条件,使用显微镜进行观察,既保证孢子囊和伴孢晶体的良好分离,又不破坏伴孢晶体。最终选定的优化条件如下:间隔时间为0.1 s,超声时间为2 s,超声次数为90次。

2.2 水悬液制备方法的改进

在洗涤过程中,传统方法是在离心后将溶液直接制成水悬液,不能使晶体蛋白分散均匀。本实验采用增加质量分数为0.01%的 Triton X-100的用量,加超声波处理(处理条件:间隔时间为0.1 s,超声时间为1 s,超声次数为20次),使晶体蛋白在悬浮剂中均匀分散。传统的液体双相分离法纯度不够,本实验在液体双相分离前对水悬液作进一步处理,在很大程度上提高了晶体蛋白的纯度和产率。

2.3 紫外线辐射条件的改进

传统方法中,经常使用紫外线来处理半成品以避免细菌滋生,但是紫外线具有破坏伴孢晶体的特性。为了证实这一点进行了对照实验,用小菜蛾测定伴孢晶体的活性。研究发现,辐射10 min,毒力效价从80 000 IU/mg降到了30 000 IU/mg,这说明用紫外线照射半成品会严重降低伴孢晶体的活性。因此,不用紫外线辐射来杀菌,而采用在无菌操作台操作,收到了很好的效果。

2.4 分离晶体的纯度鉴定

本实验采用涂片镜检,采用革兰氏染色法计算出晶体的纯度。对提纯后的晶体进行染色镜检,选择10个视野,计算平均值。采用此方法求得产品的纯度在90%以上。同时采用电子扫描电镜进行观察,放大6 000倍在电镜下可清晰地观察到菱形或矩形的伴孢晶体。

2.5 产品毒力效价的测定

伴孢晶体的毒力效价是衡量其活性的一个重要指标,采用国家标准浸液饲喂法进行毒力测定,用已配制好的不同浓度的标准样品和产品悬浮液浸泡定量的莲花白菜叶。供饥饿24 h的三龄初小菜蛾饲食,48 h后检查小菜蛾的死亡情况,结果见表1。

表1 产品毒力效价的测定结果Tab.1 Testing result on toxicity efficiency of product

将测定质量浓度转换成对数值,将校正死亡率转换成死亡几率值,进行直线拟合,得到标准品和产品的回归方程、半数致死量L C50值及其毒力效价。标准品的回归方程为y=3.231 7+1.362 1x,相关系数为0.919,半数致死量为19.871 mg/L。样品的回归方程为y=5.300 6+1.569 6x,相关系数为0.960,半数致死量为0.643 mg/L。由此求得样品的毒力效价为556 264.4 IU/mg。由表1可以得出,样品和标准品的回归相关系数均不低于0.919,说明稀释质量浓度对数值与死亡几率值呈现高度相关,制剂质量浓度与测定昆虫死亡关系密切,测定结果比较可靠有效,产率从原来的 20%提高到了28%。同时,校正死亡率及几率值随质量浓度的降低而递减,能够达到检测要求。从测定的结果看,此方法分离所得到产品的毒力效价远远高于传统方法得到产品的毒力效价。

3 结 语

1)通过显微镜观察深入研究了超声波分离伴孢晶体的条件,认为间隔时间为0.1 s,超声时间为2 s,超声次数为90次是比较优化的条件。

2)通过大量的实验佐证,认为对半成品进行紫外线辐射灭菌将严重影响产品的活性,提出采用无菌操作台来完成操作,省去了紫外线辐射步骤,使产品活性大大提高。

3)改进了悬浮液溶剂,提高了蛋白的分散均匀性。产品经染色镜检纯度在90%以上,电镜观察晶型良好,毒力效价测试为556 264.4 IU/mg,产率从原来的20%提高到了28%。本方法成本低,产率高,操作简单,应用前景广阔。

[1]赵新民,黄 凡,付祖姣,等.杀线虫苏云金芽孢杆菌研究进展[J].农药,2007,46(5):296-299.

[2]刘金环,薛 静,宋富平.苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析[J].植物保护,2006,32(6):22-26.

[3]李海涛,王洪成,刘志洋.Bt杀虫晶体蛋白的研究概述[J].黑龙江农业科学,2004(5):37-39.

Isolation and purification of protein crystal from Bt

YANG Kai-jie
(Polytechnic Department,Xingtai University of Broadcast and Television,Xingtai Hebei 054000,China)

There are many methods such as liquid double phase,density gradient,sediment,bio-physics separation and so on,frequently used to isolate and purify the protein crystal from bacillus thuringiensis(Bt).However,these methods have their own defects as well as advantages.In this paper,the isolation cost,the equipment,the purity,the output and the activity were considered.Three improvements on ultrasonic wave process,suspension liquid preparation and ultraviolet ray radiation were made.Thus,a new method to separate crystal protein from Bt was set up.This technology has a characteristic of low cost,simple operation and high application.The production ratio is improved from 20%to 28%with the product purity of 90%.

bacillus thuringiensis(Bt);isolation and purification;protein crystal

Q939

A

1008-1534(2011)04-0254-03

2010-07-07;

2011-03-29

责任编辑:张士莹

杨开杰(1964-),男,河北邢台人,讲师,主要从事生物农药方面的研究。