Acetobacter xylinumNUST4.2摇瓶发酵细菌纤维素的动力学研究

殷智超，马 波，朱春林，孙东平

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽六安237012；3.南京理工大学化工学院，江苏南京 210094）

AcetobacterxylinumNUST4.2摇瓶发酵细菌纤维素的动力学研究

殷智超1，2，马 波3，朱春林3，孙东平3

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽六安237012；3.南京理工大学化工学院，江苏南京 210094）

研究了细菌纤维素生产菌株AcetobacterxylinumNUST4.2的发酵动力学特性，建立了基于Logistic方程的菌体生长动力学、产物生成动力学、底物消耗动力学，得到了描述摇瓶发酵过程的动力学模型及模型参数，模型与实验数据拟合良好，反映了该菌株分批发酵过程的动力学特征。

AcetobacterxylinumNUST4.2；细菌纤维素；发酵动力学模型

细菌纤维素（BC）是由某些微生物合成得到的超纯纤维素，由D－葡萄糖以β－1，4糖苷键连接而成的链状多糖高分子，具有（C6H10O5）n的组成［1］。与植物纤维素相比，BC具有纯度高、结晶度高、重合度高、吸水性强、抗张强度好、生物适应性强等独特的性质，广泛应用于食品、生物医学、造纸、声学器材、化妆品、三次采油、膜滤器、环保纸杯等领域［2］［3］。

发酵动力学主要是研究发酵过程中诸如菌体浓度、底物浓度、产物浓度等状态变量随时间的变化规律及其控制变量（温度、pH值和溶氧等）之间的关系。数学模型的建立能够以简化的形式表征发酵过程行为，可用于进行工艺优化和计算机模拟，检测出可能重要但被忽视了的参数，并且有助于阐明反应机理和代谢过程。本文构建了AcetobacterxylinumNUST4.2摇瓶发酵细菌纤维素的动力学模型。

1 材料与方法

1.1 菌种

AcetobacterxylinumNUST4.2由本实验室筛选并保藏。

1.2 试剂

斜面培养基（w／v）：葡萄糖3.0%，蛋白胨1.0%，柠檬酸0.115%，磷酸氢二钠0.27%，硫酸镁0.025%，琼脂1.8%，自来水定容，调节pH至6.0。

种子培养基（w／v）：葡萄糖2.0%，玉米浆0.6%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.04%，硫酸铵0.6%，自来水定容，调节pH至6.0。

发酵培养基（w／v）：葡萄糖1.8%，蔗糖2.1%，玉米浆2.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.04%，自来水定容，调节pH至6.0。

纤维素酶液：取1g纤维素酶（国药集团化学试剂有限公司）用0.1mol／L pH4.8柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液溶解，定容至100ml，4℃冰箱保存备用。

1.3 培养方法

由斜面培养基挑取一环活化好的菌种接入种子培养基，29℃、120r／min摇床振荡培养18h，然后以8%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，29℃、120r／min摇床振荡培养6d。

1.4 分析方法

1.4.1 菌浓测定

取发酵液10mL，加入10mL纤维素酶液，40℃振荡水解2h。静置取上清液，均分为2份，其中一份以0.22μm的微孔过滤器过滤除菌作为空白对照，在600nm处测吸光度。

1.4.2 残糖测定

采用改进的3，5－二硝基水杨酸（DNS）比色法测定［4］。

1.4.3 产量测定

收获产物，3000r／min离心，水洗2次产物，然后浸泡于4%（w／w）NaOH溶液中80℃水浴保温2h，再用水洗涤至pH为中性，置于80℃烘箱中烘干至恒重，室温冷却称重。

2 结果与分析

2.1 生长细菌纤维素发酵过程的参数变化

AcetobacterxylinumNUST4.2发酵生产细菌纤维素过程中菌体浓度、残糖浓度、细菌纤维素产量的变化见图1所示。

图1 细菌纤维素发酵过程的参数变化

2.2 菌体生长模型

由图1可以看出，微生物的生长呈现明显的S型，因此，采用Logistic方程来拟合菌体的生长。Logistic方程是典型的S型曲线，在描述微生物生长方面被广泛应用，效果较好。Logistic方程可以很好的拟合出微生物生长过程的迟滞期、对数期和稳定期［5］。Logistic方程微分形式如下：

其中，X为菌体浓度，Xm为最大菌体浓度，μm为菌体细胞的最大比生长速率，t为时间。

Logistic方程的设计思想是比生长速率μ＝dX／（X·dt）随菌体浓度X的增大而减小，因为微生物的生长条件有限，菌体浓度越大，微生物个体对限制性底物的竞争必然越激烈，导致比生长速率的减小，当菌体浓度达到一定值，这种竞争达到最大，比生长速率降至0，表现为微生物生长稳定期。由Logistic方程可以看出，发酵初期，菌体浓度X远远小于Xm，因此X／Xm项忽略不计，此时菌体呈对数生长；而发酵后期，菌浓达最大值，为Xm，此时方程表示的生长速率为0，即，菌生长至稳定期。

对式（1）进行积分，得到：

其中，X0为初始菌浓。

用GraphPad Prism软件按式（2）对图1中的菌浓（即：600nm下降解了细菌纤维素的发酵液的吸光度值）进行拟合，结果见图2和表1：

图2 Logistic方程拟合Acetobacter xylinumNUST4.2生长曲线

由图2可以看出，拟合值与实测值基本相符，变化趋势一致。

表1 Logistic模型的参数估计值

表1中列出各参数的最佳拟合值、标准误差和95%置信区间。

GraphPad Prism软件还给出此拟合的决定系数R2为0.9925，说明拟合较好，Logistic方程能很好的模拟AcetobacterxylinumNUST4.2发酵生产细菌纤维素的菌体生长过程。

将表1中的参数估计值代入式（2），得到细菌纤维素发酵的AcetobacterxylinumNUST4.2菌体浓度随时间的变化关系式：

2.3 产物生成模型

AcetobacterxylinumNUST4.2发酵的产物生成模型采用Luedeking－Piret方程，其表达式为：

其中，P为产物浓度；α，β为常数。

Luedeking－Piret方程概括了伴随着菌体生长和独立于菌体生长之外两部分的产物生成速率。

将式（1）和（2）代入式（4）并积分得：

代入t0时刻的产量P0＝0，以及2.2中得到的拟合参数值：Xm＝0.3441，μ＝0.07378，X0＝0.003738，得：

用GraphPad Prism软件按式（6）对图1中测得的产量数据进行拟合，结果见图3和表2。

图3 Luedeking－Piret方程拟合产细菌纤维素曲线

由图3中的拟合曲线可以看出，发酵初期没有细菌纤维素生成，在AcetobacterxylinumNUST4.2生长约24h后才有产物合成，拟合曲线在纵坐标零点以下的部分应当舍去，因发酵的产量不可能为负值。

表2 Luedeking－Piret模型的参数估计值

表2给出了产物生成模型中各参数的最佳拟合值、标准误差和95%置信区间。最佳拟合的α，β值均不为0，说明AcetobacterxylinumNUST4.2发酵细菌纤维素的产物形成过程为生长部分偶联型，这一点从图3也可以看出，产物在微生物生长到一定阶段时开始随微生物的生长而生成。

软件分析给出拟合曲线的决定系数R2＝0.9937，说明预测值与实验值拟合的良好，Luedeking－Piret方程运用得当。

将表2中得到的参数估计值代入式（6）中，得到细菌纤维素的生成随时间的变化关系式：

其中，当P＞0时，方程有实际意义。

2.4 底物消耗模型

AcetobacterxylinumNUST4.2发酵的底物消耗模型采用类似Luedeking－Piret模型，认为限制性底物葡萄糖的消耗分为三部分：菌体生长、产物合成和细胞内源维持。基质消耗的模型表达式：

其中，S为限制性底物葡萄糖浓度，Yx／s为菌体对底物的得率系数；Yp／s为产物对底物的得率系数；m为细胞维持系数。

将式（1）、式（2）和式（4）代入模型（8），得：

代入相关数据，用GraphPad Prism软件按式（13）对图1中测得的残糖浓度进行拟合，结果见图4和表3：

图4 限制性底物葡萄糖的消耗拟合曲线

由图4看出，限制性底物的消耗基本符合模型假设，在菌体生长和产物生成速率较高的时候，葡萄糖的消耗速率也相应较高。

表3 基质消耗模型的参数估计值

表3给出了基质消耗模型中各参数的最佳拟合值、标准误差和95%置信区间。

软件分析给出拟合曲线的决定系数R2＝0.9801，说明预测值与实验值拟合的良好，基质消耗模型的选取是合适的。

将表3中得到的参数估计值代入式（13）中，得到限制性基质葡萄糖随时间的变化关系式：

3 结论

在本实验室自行优化的稳定发酵条件下构建出了AcetobacterxylinumNUST4.2摇瓶发酵细菌纤维素的动力学模型。

菌体生长模型：

产物生成模型：

［1］Vandamme E J，De Baets S，Vanbaelen A，et al.Improved Production of Bacterial Cellulose and Its Application Potential［J］.Polymer Degradation and Stability，1998，59：93－99.

［2］Jonas R，Farah L F.Production and Application of Microbial Cellulose［J］.Polym Degrad Stab，1998，59（1）：101－106.

［3］Klemm D，Schumann D，Udhardt U，et al.Bacterial Synthesized Cellulose——Artificial Blood Vessels for Microsurgery［J］.Prog Polym Sci，2001，26（19）：1561－1603.

［4］Zhou L L，Sun D P，Hu L Y，et al.Effect of Addition of Sodium Alginate on Bacterial Cellulose Production by Acetobacter xylinum［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆Biotechnology，2007，34：483－489.

［5］Kaushik Nath，Manoj Muthukumar，Anish Kumar，et al.Kinetics of Two－stage Fermentation Process for the Production of Hydrogen［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33：1195－1203.

Studies on Fermentation Kinetics of Acetobacter xylinumNUST4.2 Producing Bacterial Cellulose in Shake Flask

YIN Zhi－chao1，2，MA Bo3，ZHU Chun－lin3，SUN Dong－ping3

（1.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEengineering，WesternAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.AnhuiProvincePlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012China；3.SchoolofChemicalEngineering，NanjingUniversityofScienceandTechnology，Nanjing210094，China）

The fermentation kinetics of bacterial cellulose－producting strain Acetobacter xylinum NUST4.2was studied.A kinetic model was established based on the Logistic equation for cell growth，product formation and substrate consumption during fermentation in shake flask.The model fitted well and gave a reasonable description of the batch fermentation process.

Acetobacter xylinum NUST4.2；bacterial cellulose；fermentation kinetics model

Q815

A

1009－9735（2011）05－0088－04

2011－10－01

安徽省教育厅自然科学基金重点项目资助（KJ2010A328，KJ2011A272）。

殷智超（1987－），女，安徽金寨人，皖西学院生物与制药工程学院助教，硕士，研究方向：微生物发酵。