蛇足石杉内生真菌的分离与鉴定

闵长莉，柴翠英

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽六安 237012）

蛇足石杉内生真菌的分离与鉴定

闵长莉1，2，柴翠英1

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽六安 237012）

从健康蛇足石杉的茎中分离内生真菌，用PDA培养基分离纯化菌株，对照真菌鉴定手册，根据菌株的菌落形态、大小、颜色、生长速率以及菌丝体和孢子的形态特征进行鉴定。从蛇足石杉的茎中分离出5株内生真菌，经鉴定它们分别属于链格孢霉属、镰刀菌属、无孢类群和青霉属。

蛇足石杉；内生真菌；分离；鉴定

蛇足石杉（Huperziaserrata（Thunb）.Trev.），又名千层塔、蛇足草、宝塔草等，是一种珍贵的药用蕨类植物。在民间，蛇足石杉全草被用于治疗跌打损伤、瘀血肿痛、精神分裂、肌肉痉挛、胆结石引起的剧疼等。外用可治痈疽、疥疮，并可灭虱及臭虫等［1］。近年来的研究发现，蛇足石杉的活性成分石杉碱甲具有很强的抑制胆碱脂酶活性，具有提高学习记忆力和改善老年记忆功能的效果，并且对治疗重症肌无力和早老性痴呆均有显著疗效［2］。临床上石杉碱甲已用于治疗各种原因和不同年龄组的老年人记忆减退和早期老年痴呆症，目前国际上已将石杉碱甲列为第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂之一［3］。由于石杉碱甲在全草中含量甚微，且其结构复杂，所以人工合成十分困难。蛇足石杉资源稀少，目前还不能人工栽培，药品生产要完全依赖野生资源，必将直接影响石杉碱甲进一步的开发与利用，同时还会造成蛇足石杉资源的枯竭。因此，研究蛇足石杉中石杉碱甲资源的新来源显得尤为重要。

植物内生真菌（Endophytic fungi）是指生活在植物体内或一定阶段处于植物体内，包括菌根真菌和植物病原菌［4］（P179－197）。近年来的研究发现，植物内生真菌能产生新的天然产物，甚至可以产生与宿主植物相同或相近的代谢产物，因而成为天然产物的重要来源［5］。近些年来，对药用植物内生真菌的研究十分活跃，人们已经从红豆杉属、长春花、桃儿七、喜树等珍贵植物中分离出能够产生活性成分的内生真菌［6－9］。本实验主要对蛇足石杉植株内生真菌进行了分离纯化与菌种鉴定，以期为进一步研究蛇足石杉内生真菌能否合成石杉碱甲奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料来源 蛇足石杉植株于2011年5月采自安徽天堂寨景区海拔约1100m处，经妥善处理后带回实验室供试。

1.1.2 仪器与试剂 恒温恒湿培养箱（PYX－150H－A，科立仪器）；电热蒸汽压力消毒器（YX－450，上海三申医疗器械有限公司）；洁净工作台（SW－CJ－1C（U），苏州安泰空气技术有限公司）。

1.1.3 培养基 PDA固体培养基：将200g新鲜的马铃薯洗净去皮，切成小块后加入适量水，煮沸1h，纱布过滤，取滤液，加入葡萄糖20g、蛋白胨2.0g、琼脂20g，加水定容至1000mL，1.05kg／cm2高压蒸汽灭菌30min即可。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离方法 将所采集健康的蛇足石杉植株在自来水下洗净后，将其茎部剪成约2cm长的小段，依次将茎置于75%乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗3次，10%NaClO浸泡5min，无菌水冲洗3次，75%乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗3次。在无菌的条件下，用剪刀将茎剪成0.5cm的小段。将上述材料接种到PDA固体培养基上，倒置于28℃培养箱中培养。同时将上述消毒过程中最后一次冲洗样品的无菌水加在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底，保障所分离到的菌株是内生真菌。观察样品切口处是否有菌丝长出，待菌丝长出后，作进一步纯化。

1.2.2 内生真菌纯化 2～3d后，无菌操作挑取上述样品边缘所长出的菌丝，划线转接于新的PDA平板上，进行纯化培养，经几次划线分离，得到形态完全一致的单菌落即纯化的内生真菌。观察纯化后的菌株，记录各菌株的菌落形态、颜色、质地及其生长速度。

1.2.3 内生真菌的形态学鉴定 将PDA培养基熔化后，以每平皿15－18mL的量倒平板，凝固后将待鉴定菌种划线接种于平板，然后取灭过菌的盖玻片以45°角插入培养基内，深度约为盖玻片的1／3，盖上皿盖，于28℃培养，每天观察菌落表面形态、大小、颜色、质地、生长速度和边缘形态；根据生长情况取出盖玻片，在显微镜下观测培养过程中的菌丝、产孢结构和分生孢子梗着生情况，孢子形态与颜色等特征参考文献［10］［11］进行鉴定。菌种于4℃冰箱保藏，每3个月复壮1次。

2 结果分析

2.1 内生真菌分离结果

试验以丝状真菌为主要分离目标，经过分离、筛选、纯化的反复过程，从皖西大别山蛇足石杉的茎中共分离得到了5个纯化的真菌。同期对照组中最后一次冲洗组织块的无菌水中没有任何菌落长出，证实分离到的5株真菌均为内生真菌。

2.2 内生真菌的特征与鉴定

2.2.1 WX001菌株：该菌在生长初期，菌落直径较小，菌落初为白色，随着培养时间的延长，后期变为灰绿色，绒毛状，边缘较整齐；生长速度较快，在PDA培养基上培养3d直径达4cm左右。在显微镜下观察，分生孢子梗暗色，分生孢子暗色，倒棒行，有纵横隔。根据菌落的形态学特征对照相关的分类系统，初步鉴定该菌株属于半知菌亚门丝孢目暗色孢科链格孢属（Alternaria）。

2.2.2 WX002菌株：该菌株菌落表面白色，边缘不太整齐，棉絮状，菌丝较致密，且生长速度较慢，在PDA培养基上培养3d直径可达2.5cm左右，10d后直径达6cm左右。显微观察可见菌丝无色有隔，大型孢子细长型，多隔。根据菌落的形态结构及该菌的显微特征，对照真菌鉴定手册，初步判定该菌株为半知菌亚门瘤座孢目瘤座孢科镰刀菌属（Fusarium）。2.2.3 WX003菌株：该菌在生长初期，菌落直径较小，菌落表面白色，绒毛状，边缘较整齐。随着培养时间的延长，菌落直径逐步变大，至培养3d时，可达3.6cm，且颜色变深为灰绿色。显微镜下可见菌丝有隔膜，分支较少，未见核，没有孢子产生。根据形态学特征对照相关的分类系统，将该菌株初步鉴定归属为半知菌亚门无孢类群（Myceliasterlia）。

2.2.4 WX004菌株：该菌生长速度较慢，在PDA培养基上培养5d后菌落直径可达2cm左右，菌落呈青绿色绒毛状，边缘较整齐，菌落反面为黄色。显微观察可见菌落气生菌丝发达，表面有绿色粉粒状结构，有横隔，分生孢子梗不对称分支、竹结状，分生孢子串生于分生孢子梗顶端，分生孢子单胞、椭圆形，无色光滑。根据形态学特征对照相关的分类系统，将该菌株初步鉴定归属为半知菌亚门丛梗孢目丛梗孢科青霉属（Penicillium）。

2.2.5 WX005菌株：该菌株生长速度较慢，在PDA培养基上培养3d后菌落的直径为2.3cm左右，白色绒毛状，边缘不太整齐，菌落反面为淡黄色。显微镜观察可见菌丝无色，有隔，分枝较少，没有孢子产生，根据形态学特征对照相关的分类系统，将该菌株初步归属为半知菌亚门无孢类群（Myceliasterlia）。部分内生真菌孢子显微图片见图1。

图1 部分内生真菌的孢子结构（400倍）

3 讨论

本实验采用组织块法对蛇足石杉外植体的内生真菌进行分离纯化。在实际操作过程中，内生真菌分离所用的样品在采集时已尽量减少污染的机会，样品在48小时内分离。从样品中分离出5株真菌；同期对照组中最后一次冲洗组织块的无菌水中没有任何菌落长出，证实分离到的5株真菌均为蛇足石杉的内生真菌。

5种内生真菌分别隶属于半知菌亚门丝孢目暗色孢科链格孢属、半知菌亚门瘤座孢目瘤座孢科镰刀菌属、半知菌亚门丛梗孢目丛梗孢科的青霉属和半知菌亚门无孢类群，由此可以看出，蛇足石杉植物体内具有丰富的内生真菌。由于本次实验的样品只是选取植物体的茎尖部分，对于叶、根部内生真菌并没有进行研究，所以有些蛇足石杉内生真菌可能并没有被分离出来。就蛇足石杉内生真菌而言，今后应继续扩大内生真菌分离的数量和种类，并对分离的菌株能否合成石杉碱甲进行鉴定，以论证蛇足石杉内生真菌发酵生产石杉碱甲的可行性。

［1］邵浩，吕会芳，张丽.石杉碱甲药源植物研究进展［J］.上海中医药大学学报，2009，23（2）：83－86.

［2］余红英，孙远明，杨跃进.草药蛇足石杉的研究进展［J］.中草药，2001，32（3）：279－281.

［3］王斌，何煦昌，白东鲁.老年痴呆药物石杉碱甲类似物研究V.光学活性（－）－1－甲基石杉碱甲的合成［J］.药学学报，1999，34（6）：434－438.

［4］Petrini O.Fungal Endophytes of Tree Leave［A］.In：Andrews JH，Hirano SS.Microbial Ecology of Leaves［C］.Hardcover：SpringerVerlag，1991.

［5］Verma VC，Kharwar RN，Strobel GA.Chemical and Functional Diversity of Natural Products from Plant Associated Endophytic Fungi［J］.Nat Prod Commun.2009，4（11）：1511－1532.

［6］王兴红.内生真菌与天然产物研究进展［J］.中草药，2007，38（1）：140－143.

［7］顾谦群，温江妮，朱天骄，等.药用植物内生真菌——天然活性产物新资源［J］.中国海洋大学学报，2006，36（3）：365－369.

［8］孙剑秋，郭良栋，臧威，等.药用植物内生真菌及活性物质多样性研究进展［J］.西北植物学报，2006，26（7）：1505－1519.

［9］闵长莉，汪学军.喜树产10－羟基喜树碱内生真菌的分离鉴定［J］.西北植物学报，2009，29（3）：614－617.

［10］Barnett H L，Hunter B B.The Diagram of the Fungi Imperfectic［M］.Beijing：Science Press，1977.

［11］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.

Isolation and Identification of Endophytic Fungus from Huperzia serrata

MIN Chang－li1，2，CHAI Cui－ying1

（1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，WestAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.PlantBiotechnologyTrainingCenterofAnhuiProvince，Lu’an237012，China）

In this paper，Endophytic fungi were isolated from the healthy tip stem of Huperzia serrata.The endophytic fungi were cultured in PDA medium and purified by the methods of agar plate.At the same time the endophytic fungi were identified by observing colony morphology，size，color，and the growth rate of mycelium and spores of the morphological features by comparing the Identification Handbook of Fungus.The results showed that there were five endophytic fungi species isolated from the tip stem of Huperzia serrata，which respectively belonged to Alternaria，Fusarium，Mycelia sterlia and Penicillium.

Huperzia serrata（Thunb）.Trev.；endophytic fungi；isolation；identification

Q934.1

A

1009－9735（2011）05－0011－03

2011－10－01

国家自然科学基金项目（31100019）；安徽省高等学校省级自然科学研究项目（KJ2011B207）；皖西学院学生研究性学习项目（wxxy2011009）。

闵长莉（1975－），女，安徽霍邱人，皖西学院生物与制药工程学院讲师，硕士，研究方向：微生物药物学。