皖贝母内生真菌的初步研究

杨 宇，汪学军，韦传宝，2，余茂耘，吴琪瑶

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽六安237012；3.安徽大学生命科学学院，安徽合肥 230039）

皖贝母内生真菌的初步研究

杨 宇1，汪学军1，韦传宝1，2，余茂耘1，吴琪瑶3

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽六安237012；3.安徽大学生命科学学院，安徽合肥 230039）

采用平板分离法从皖贝母新鲜鳞茎、茎杆和叶中分离出2种内生真菌（A1和B1），通过菌落形态和ITS序列确定内生菌的种属，通过DNAMAN软件多重序列比对确定与其他真菌的同源关系。结果表明，A1归为被孢霉属，与Mortierella elongata的ITS序列同源性高达99.44%；另一种归为青霉属，与Penicillium janthinellum的ITS序列同源性高达98.65%。

皖贝母；内生真菌

内生菌（endophyte）是指在其生活史的某一阶段或整个时期生活于植物组织器官内部，而不引起被浸染的宿主植物发生明显性状改变的菌类，主要包括真菌、放线菌和细菌。研究表明，某些内生菌能够促进植物次生代谢产物的合成，并且具有与宿主植物相似的代谢途径，产生相同的活性次生代谢产物［1］。因此，植物内生菌作为新的微生物资源受到广泛关注。

皖贝母（Fritillaria anthuiensis S.C.Chen et S.F.Yin）属于百合科（Liliaceae）贝母属（Fritillaria L.）药用植物［2］，在安徽省种植较多，是安徽省名贵中药材［3］，可用于治疗急、慢性支气管炎等疾病［4］。目前，对贝母属植物内生菌的研究很少，国内仅叶波平等从浙贝母［5］、祝兴伟等从伊犁贝母［6］中分离出内生真菌。本文以皖贝母新鲜鳞茎、茎杆和叶为材料，分离其内生菌，通过测定其ITS序列鉴定其种属，通过DNAMAN软件多重序列比对确定与其他真菌的同源关系，为研究皖贝母内生菌奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从安徽省霍山县采集健康的皖贝母鳞茎备用。

1.2 方法

1.2.1 皖贝母内生真菌的分离与保藏

在无菌条件下将皖贝母鳞茎表面清洗干净，晾干后用75%酒精浸泡1.5min，无菌水冲洗1次，10%次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水冲洗1次，再用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗干净。将鳞茎切割成0.5× 0.5cm2的块状，截面向下置于含青霉素的马铃薯葡萄糖培养基中（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml，pH自然），最后一次冲洗液作为对照。28℃条件下培养，观察期间菌落形态、颜色等特征，将形态、颜色不同的菌落转接到新的固态培养基上，编号，28℃培养3～7d，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 皖贝母内生真菌的形态学观察及初步分类

观察并记录各菌落的形态。参照沈萍等透明胶带法［7］（P74）制作临时装片，用低倍镜、高倍镜进行镜检，并置于油镜下观察、拍照保存。

1.2.3 皖贝母内生真菌的分子生物学鉴定

选择不同形态的真菌进行ITS序列测序，每种真菌独立测定3株，由上海生工生物工程有限公司完成。将测序结果与GenBank数据库中的基因序列进行Blast分析，结合形态学特征确定内生菌的种属；通过DNAMAN软件将ITS序列与GenBank数据库中近缘种序列进行多重序列比对，用DNAMAN软件中Observe Divergency方法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 皖贝母内生真菌的分离与保藏

从皖贝母鳞茎、茎杆和叶中共发现2种不同形态的真菌，分别标号A、B，每种选择3株保存，分别标号A1、A2、A3、B1、B2和B3。

2.2 内生真菌的形态学观察

A1、A2和A3形态一致，毛毡状，表面灰绿色，附着絮状绒毛，背面暗黄色，孢子为孢囊孢子，孢囊梗呈伸长丝状，几乎不分枝，孢子囊顶生球形，以A1作为代表，形态见图1。B1、B2和B3形态一致，白色，毛毡状，有辐射状褶皱，附着絮状绒毛，背面略呈橘黄色，孢子为分生孢子，孢子梗分生呈扫帚状，孢子球形串生，以B1作为代表，形态见图2。

图1 A1孢囊孢子、孢囊及孢囊梗

图2 B1分生孢子及孢子梗

2.3 内生真菌的分子生物学鉴定

测序结果显示A1、A2和A3序列相同，以A1作为代表；B1、B2和B3序列相同，以B1作为代表。序列经同源序列比对，发现与A1的ITS序列同源性最高的4株为Mortierella属；与B1的ITS序列同源性最高的4株为Penicillium属。使用DNAMAN软件中Observe Divergency方法构建系统进化树，结果表明：A1的ITS序列与GenBank中12个近缘种（表1）序列同源性为65.67%～99.44%，其中Mortierella elongata与A1的ITS序列同源性高达99.44%，Mortierella indohii与A1的ITS序列同源性最低，为65.67%（图3）。B1的ITS序列与GenBank中17个近缘种（表2）序列同源性为80.36%～98.65%，其中Penicillium janthinellum与B1的ITS序列同源性高达98.65%，Penicillium purpurogenum与B1的ITS序列同源性最低，为80.36%（图4）。

表1 A1与12个近缘种Genbank登录号及拉丁名

表2 B1与17个近缘种Genbank登录号及拉丁名

图3 A1的ITS序列与GenBank中12个近缘种序列同源进化分析

图4 B1的ITS序列与GenBank中17个近缘种序列同源进化分析

3 讨论

从现有的研究结果来看，贝母类植物内生菌种类较多，而且分属于不同的科属。祝兴伟等人从伊犁贝母中分离的内生菌尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum Y1属于镰刀霉属［6］；叶波平等人从浙贝母中分离的内生菌Nectria sp.JZ6属于丛赤壳属［5］；本文从皖贝母中分离的内生菌长被孢霉属于被孢酶科，被孢霉属成员；而另一种内生菌微紫青霉属于曲霉科，青霉属成员。长被孢霉因其含有丰富的γ－亚麻酸（GLA）、花生四烯酸（ARA）［8］，二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），广泛被研究用于生产多不饱和脂肪酸，东京大学农化系已从长被孢霉IS－4获得了500mg／L EPA的产量［9］；微紫青霉对重金属离子有较强的吸附能力，可用于重金属污水的处理［10］［11］；本文分离的长被孢霉和微紫青霉是否有这些功能尚待进一步研究。

［1］Stierle A，Strobel G，Stierle D.Taxol and Taxane Production by Tanomyces Andreanea，an Endophytic Fungus of Pacific Yew［J］.Science，1993，260：214－216.

［2］殷淑芬.安徽贝母属新植物［J］.植物分类学报，1983，21（1）：100.

［3］谢中稳，张智.安徽贝母种子资源及其利用［J］.植物学通报，1994，（2）：56－57.

［4］李成网，李清华.薄层扫描法测定皖贝精胶囊贝母素甲的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2001，7（3）：21－22.

［5］叶波平，张少华，刘冰，等.浙贝母内生真菌Nectria sp.JZ6分泌抑菌活性代谢产物的初步研究［J］.菌物学报，2009，28（4）：603－609.

［6］祝兴伟，张少华，王治维，等.一株来自于伊犁贝母的内生尖孢镰孢菌Y1的抑菌活性初步研究［J］.菌物学报，2009，28（3）：349－353.

［7］沈萍，陈向东.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［8］雷帮星，梁宗琦，刘作易，等.利用真菌生产GLA、Ara和EPA的研究进展［J］.山地农业生物学报，2000，19（5）：388－393.

［9］魏明，曹健.利用微生物生产多不饱和脂肪酸的研究进展［J］.郑州工程学院学报，2002，23（3）：90－94.

［10］黄晓婷，梁钰，秦会娟，等.预处理方式对微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR吸附Zn2＋影响的研究［J］.广西农业生物科学，2008，27（4）：405－411.

［11］周媛，黄晓婷，黄桂海，等.微紫青霉菌菌株GXCR对低品位黄铜矿中的Cu和Fe的生物淋滤及其淋滤机制［J］.生物工程学报，2008，24（2）：1993－2002.

A Preliminary Study on Endophytic Fungi from Fritilaria anhuiensis

YANG Yu1，WANG Xue－jun1，WEI Chuan－bao1，2，YU Mao－yun1，WU Qi－yao3

（1.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEengineering，WesternAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.AnhuiProvincePlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012，China；3.CollegeofLifeScience，AnhuiUniversity，Hefei230039，China）

Two kinds of endophytic fungi（named A1and B1）were separated from fresh Fritilaria anhuiensis bulb，stem and leaf by culture dish.Their taxonomy were determined by morphology analysis and ITS analysis.The relationship with other fungi were determined by DNAMAN analysis.The results indicated that A1belongs to genus Mortierella and shared 99.44%nucleotide acid identities with Mortierella elongata ITS.B1belongs to genus Penicillium and shared 98.65%nucleotide acid identities with Penicillium janthinellum ITS.

Fritilaria anhuiensis；endophytic fungi

Q939.95

A

1009－9735（2011）05－0008－03

2011－10－01

安徽省教育厅自然科学基金重点项目资助（KJ2010A328，KJ2011A272）。

杨宇（1989－），男，安徽安庆人，研究方向：分子生物学。

韦传宝（1961－），男，安徽寿县人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向：植物病毒。