农药高效氯氰菊酯对小鼠肾细胞氧化损伤的研究

2011-01-02丁书茂秦龙娟张亚然

华中师范大学学报（自然科学版） 2011年4期

马萍，丁书茂，秦龙娟，张亚然，杜娟，杨旭＊＊

（1.咸宁学院基础医学院，湖北咸宁 437100；2.华中师范大学生命科学学院，武汉 430079）

高效氯氰菊酯（beta－cypermethrin，β－CP）是目前国内最常用一种高效、广谱、速效的杀虫剂，属于拟除虫菊酯类农药，其活性比普通的氯氰菊酯（cypermethrin，CP）高1倍，被广泛应用于农业害虫、卫生害虫、畜牧害虫、储粮害虫等的防治.随着β－CP使用范围的不断扩大和使用量的增加，长期低浓度接触β－CP引发的人类的安全性问题日益受到人们的关注，对其毒性作用的研究表明，它对人和动物神经系统、消化系统、血液系统、免疫系统和生殖系统都有影响［1－2］.李海峰等以家兔为试验材料，安丽等以大鼠为试验材料，都发现β－CP有生殖毒性［3－4］.安丽等发现，β－CP对雄性小鼠体液免疫功能有抑制作用，此种作用可能与该农药对脾脏B淋巴细胞的氧化损伤有关［5］.佟俊旺等通过彗星实验证明CP的染毒浓度80mg／kg时，能够造成小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤［6］.到目前为止，对该杀虫剂氧化损伤的研究报道较少，本研究特采用目前最常用的4.5%β－CP乳油对小鼠进行染毒，通过对小鼠肾脏ROS、GSH和DPC系数的测定研究其氧化损伤，为β－CP的生产、使用和管理提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

F－4500型荧光分光光度计（日本日立公司），荧光酶标仪（FLx 800，Bio－Tek Instrument Inc，USA），酶标仪（日本岛津），低温冷冻离心机（Eppendorf－5415R），三用电热恒温水箱（北京市长源实验仪器厂），H2DCF－DA 荧光染料（Sigma公司），蛋白酶K（Merk公司），Hoechst33258荧光染料（Sigma公司），十二烷基硫酸钠（SDS），三羟基氨基甲烷盐酸盐（Tris－HCl），5，5′－二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）.

1.2 受试农药

4.5 %高效氯氰菊酯乳油，南京红太阳股份有限公司生产.

1.3 实验动物

选用湖北省实验动物研究中心提供的SPF级雄性昆明小鼠24只，体重为30±2g，饲养1周后实验.

1.4 分组和染毒

24只昆明小鼠随机分为1个阴性对照组和3个β－CP染毒组，每组6只.参考文献［6－8］，染毒组分为低、中、高剂量组，确定染毒剂量分别为10、20和40mg／kg 3个剂量水平，β－CP以蒸馏水稀释成1、2和4mg／ml 3种浓度的使用液.由于β－CP难溶于水，故稀释液需现用现配，使用时在旋涡混悬仪上充分混匀.阴性对照组用蒸馏水.均经口灌胃给予，灌胃量为10mg／kg，每天1次，连续染毒7d，分别于实验前称小鼠体重，小鼠可以自由进食，进水.

1.5 肾脏匀浆和细胞悬液的制备

染毒结束后将小鼠颈椎脱臼处死，立即取出肾脏，在冰冷的PBS（pH＝7.5）中漂洗，滤纸拭干，称重.肾细胞分成两部分，一部分取肾脏0.2g加2mL PBS制成10%匀浆液，低温离心后取上清，用于ROS和GSH的检测.另一部分肾脏剪成糜状，过滤后将细胞滤液离心去上清，再用PBS重悬细胞，用于DPC系数的检测.

1.6 实验方法

1.6.1 活性氧（ROS）的测定取10%匀浆液2μL，加入398μL PBS作200倍稀释.取100μL稀释液于酶标板中排列，并加入100μL荧光染料DCFA染色，避光反应5min，用荧光酶标仪检测.

1.6.2 谷胱甘肽（GSH）的测定取10%匀浆液200μL于EP管中，加入50μL10%TCA，混匀后置冰上10min.10 000g离心5min，取上清，将50μL上清加50μLPBS并调节pH至7.5.取50μL样品加入酶标板，分别加入150μL浓度为60μg·mL－1的 DTNB显示液，室温避光5min，用全波长酶标仪在412nm波长下测吸光值，根据标准曲线求得GSH的浓度（以n mol／L表示）.

1.6.3 DNA－蛋白质交联（DPC）系数的测定 DPC

采用 KCl－SDS沉淀法进行检测［9－10］.首先向样品中加入SDS，使之与DPC及蛋白质结合，然后加入KCl溶液使DPC和蛋白质沉淀，而游离的DNA留在上清液中.将上清液转移后，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白质，使DPC中的DNA游离出来，用荧光法测定此DNA的含量A（交联DNA）以及原液中 DNA 的含量 B（游离 DNA），计算DPC系数η（η＝A／A＋B）.

1.7 统计分析

实验数据均采用Mean±se表示，采用Origin 7.0统计分析软件进行数据处理，并进行t检验并绘图.

2 实验结果

2.1 ROS含量的变化

不同剂量的β－CP染毒小鼠后，其肾脏ROS含量的变化如图1所示.从图1可看出，随着β－CP染毒剂量的升高，ROS含量逐渐上升，呈一定的剂量－效应关系.低剂量组（≤10mg／kg）与对照组无显著差异（p＞0.05），中、高低剂量组（≥20mg／kg）与对照组有显著差异（p＜ 0.05）.以上结果表明，较高剂量的β－CP能造成ROS含量的上升.

图1 不同剂量的高效氯氰菊酯染毒小鼠肾脏ROS含量（＊：与对照组相比较，p＜0.05）Fig.1 ROS content in mouse kidney induced by different dose of beta－cypermethrin

图2 不同剂量的高效氯氰菊酯染毒小鼠肾脏GSH含量（＊＊：与对照组相比较，p＜0.01）Fig.2 GSH content in mouse kidney induced by different dose of beta－cypermethrin

2.2 GSH含量的变化

不同剂量的β－CP染毒小鼠后，其肾脏GSH含量的变化如图2所示.从图2可看出，随着β－CP染毒剂量的升高，GSH含量逐渐下降，呈一定的剂量－效应关系.低剂量组（≤10mg／kg）与对照组无显著差异（p＞ 0.05），中、高剂量组（≥20mg／kg）与对照组有极显著差异（p ＜0.01）.以上结果表明，在较高剂量的β－CP作用下，小鼠肾脏的GSH含量有明显的下降.

2.3 DPC系数的变化

用KCl－SDS沉淀法检测DPC系数，其肾脏DPC系数变化如图3所示.从图3可看出，随着β－CP染毒剂量的升高，DPC系数逐渐上升，呈一定的剂量－效应关系.低剂量组（≤10mg／kg）与对照组无显著差异（p＞0.05），中、高剂量组（≥20mg／kg）与对照组有显著差异（p＜0.05）.

图3 不同剂量的高效氯氰菊酯染毒小鼠肾脏DPC系数（＊：与对照组相比较，p ＜0.05）Fig.3 DPC coefficient in mouse kidney induced by different dose of beta－cypermethrin

3 讨论

我国是农药生产和使用大国.长期以来，我国农药的使用表现为总量大、杀虫剂比例大、过量和不合理使用、农药残留超标现象突出等特点.农药通过食物、职业接触和居住环境接触等途径被人体吸收，严重危害人类健康［11］.高效氯氰菊酯是目前国内最常用一种杀虫剂，本研究用小鼠肾脏作ROS、GSH和DPC系数的检测来评价其氧化损伤是非常有必要的.

反映细胞内氧自由基水平的主要指标是细胞中ROS含量，机体的正常代谢可以产生一定水平的ROS，组织细胞中活性氧的主要产生者是线粒体［12］.正常细胞中，一些ROS能够被抗氧化机制所中和，比如还原型的GSH可以和ROS结合形成硫代半缩醛，氧化与抗氧化水平保持动态平衡.如果ROS生成过量，会导致GSH耗竭，机体天然的抗氧化机制将被破坏.活性氧还可通过攻击脱氧核糖、攻击胸腺嘧啶碱基、增高细胞内游离ca2＋浓度，激活Ca2＋依赖的核酸内切酶和攻击修复DNA链断裂的酶来导致DNA链断裂［11］.氧自由基对细胞的氧化损伤作用还会引起DNA－蛋白质交联［13］.DNA－蛋白质交联难以修复，对参与DNA复制、转录和修复的蛋白质活动起阻碍作用.

在本研究中，随着β－CP染毒剂量的升高，ROS含量逐渐上升，GSH含量逐渐下降，DPC系数逐渐上升，各项指标呈一定的剂量－效应关系.β－CP染毒剂量≥20mg／kg时，ROS和DPC系数有显著差异（p＜ 0.05），GSH 有极显著差异（p＜0.01）.说明在较高剂量的β－CP诱导之下细胞内产生了过量的ROS，受到ROS攻击，细胞的抗氧化能力下降，DNA和蛋白质交联增多，造成了小鼠肾脏的氧化损伤.