氯氰菊酯降解菌DZS—3的分离鉴定及其特性

马婷，李存治，毛灵琪，单风娟，闫达中

摘要：以氯氰菊酯为惟一碳源与氮源，从生产氯氰菊酯的农药厂污水曝气处理池的活性污泥样品中，通过富集驯化和划线分离，筛选出一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3。经气相色谱检测，3d内其对氯氰菊酯的降解率为65.7%。形态学观察，该菌圆形，周边光滑，革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌。通过16S rDNA序列分析及生理生化特性鉴定，将其初步鉴定为寡养单胞菌属的一种（Stenotrophomonas sp.）。

关键词：氯氰菊酯降解菌;筛选;鉴定;寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）

中图分类号：X172;Q93-331        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5708-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.022

拟除虫菊酯类（Synthetic Pyrethroids）杀虫剂是一类具有优异生物活性、环境相容性较好的农药，它是继有机磷、有机氯和氨基甲酸酯之后发展起来的一类杀虫剂[1]。该类杀虫剂是模拟植物源农药——天然除虫菊酯合成的一类含有多个苯环结构的化学农药[2，3]。

氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂中的一种，具有高效、广谱、低毒等优点，被广泛应用于果树、蔬菜的病虫防治，但其在环境中有一定的蓄积性，很难在自然条件下快速降解。氯氰菊酯的广泛使用，造成了其在农产品上的大量残留和土壤、河流的污染，给生态环境和人类自身的健康安全带来了极大的威胁。农药残留是影响我国农产品出口的重要屏障，农药残留超标势必给我国的经济造成极大的损失。虽然国内外关于处理拟除虫菊酯类农药残留的方法有很多的报道，但都不能从根本上消除农药残留的问题。如何有效地解决菊酯类农药残留的问题，成为当前人们面临的一大难题。残留在环境中的氯氰菊酯可以通过光降解、化学降解以及微生物的作用被降解。而与化学降解和光降解等方式相比较而言，农药的微生物降解具有安全、高效、费用低、无二次污染等优点，所以，以微生物降解为基础的生物修复是一种环境友好型污染物消除技术，也是去除氯氰菊酯残留的一种有效的手段。本研究旨在于分离筛选出新的高效降解氯氰菊酯的菌株，检测其对氯氰菊酯的降解能力，探讨直接用于氯氰菊酯引起的环境污染的微生物修复的可能性。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  主要仪器设备  自动凝胶成像分析仪，PCR 扩增仪，电泳仪，全自动高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，超净工作台，显微镜，生化培养箱，紫外-可见分光光度计（PE Lambda 25），气相色谱仪（Agilent）。

1.1.2  采集样品  从江苏某农药厂曝气池排污口附近土壤采集样品。

1.1.3  试剂  K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、NaCl、氯仿、环己烷均为分析纯，琼脂，牛肉浸取物，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeast extract），氯氰菊酯原药（纯度94%）（氯氰菊酯原药使用前先用乙醇或正己烷配成高浓度母液，并过滤除菌）。

1.1.4  扩增16S rDNA 引物  primer 27F： 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; primer 1492R： 5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.1.5  培养基

1）基础培养基：MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，FeSO4·7H2O 1.0 g，去离子水1 L。

2）增菌富集培养基：蛋白胨 2.0 g，NaC1 1.0 g，牛肉膏 1.0 g，去离子水 l L，pH 7.0～7.2。

3）LB培养基：NaCl 10 g，Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，去离子水 l L，pH 7.0。

往上述培养基中加入2%的琼脂粉即为固体培养基。

1.2  方法

1.2.1  氯氰菊酯降解菌的分离纯化  称取污泥5 g，加入灭菌的装有100 mL去离子水的三角烧瓶中，170 r/min、30 ℃，在摇床上振荡1周，充分释放污泥中的微生物[4]，然后将上清液5 mL和曝气池液体5 mL加入到含氯氰菊酯浓度为50 mg/L的100 mL液体基础培养基中，在摇床上30 ℃、170 r/min培养。按3%的接种量，每7 d转接1次，每转接1次氯氰菊酯浓度提高50 mg/L，直到氯氰菊酯浓度为250 mg/L。交替使用乙醇和正己烷溶解氯氰菊酯以消除溶剂对试验的干扰，确保筛选出的菌株能够利用氯氰菊酯农药作为惟一碳源、氮源生长。取菌液按100，10-2 ，10-4，10-6 进行做4个梯度的稀释（每个梯度设3个重复）后涂布于含氯氰菊酯的固体基础培养基平板上，于30 ℃培养箱中培养。待长出菌落后，按照菌落形态、大小、颜色不同挑取单菌落在含氯氰菊酯的固体基础培养基平板上划线分离，纯化菌株，直到得到单一、均匀的单菌落。

1.2.2  紫外分光光法初步鉴定高效降解菌株  将筛选得到的生长良好的单菌落接入3 mL液体富集培养基中，30 ℃、170 r/min摇床过夜培养。按3%的接种量将过夜培养的菌液转接到含100 mL富集培养基的三角瓶中，培养至OD600 nm=0.6左右，7 000 r/min、5 min离心收集菌体。并用磷酸缓冲液洗两次。用磷酸缓冲液悬浮菌体，并调OD600 nm=1.0。按3%的接种量接种到5瓶10 mL的液体基础培养基中（氯氰菊酯浓度为100 mg/L）培养，以不加菌为对照，1、3 d 取样，每个样做3个重复，以三氯甲烷为萃取剂双倍体积萃取。三氯甲烷萃取后用紫外可见分光光度计于200～700 nm波长下扫描确定氯氰菊酯的特征吸收峰，检测氯氰菊酯的降解情况，以确定降解效果最好的菌株。

1.2.3  高效降解菌株降解率的确定  将降解效率最高的菌株按与“1.2.2”基本相同的步骤操作，其中氯氰菊酯的含量为10 mg/L，取样点为1 、3 、5 、7 、9 d。最后用环己烷双倍体积萃取氯氰菊酯，无水硫酸钠除去样品中的水，每个样做3个重复，用气相色谱检测氯氰菊酯的含量。

气相色谱条件[5]：气相色谱仪为7 890A（带工作站），载气：99.999%N2，平均线速度：65 cm/L，不分流进样，进样量为1 μL ，毛细管柱（30 mm×0.53 mm× 1.5 μm）。进样口温度为250 ℃，ECD检测器，检测器温度为300 ℃，柱温采用程序升温：初温为150 ℃升温至280 ℃，在此温度保持10 min。

1.2.4  高效降解菌生长曲线的绘制  将对氯氰菊酯降解率最高菌株富集后按1%的接种量接种到含0.01%的Yeast extract的液体基础无机盐培养基中，30 ℃、170 r/min培养，0、1、3、5、7 、9 d取样，测定其相应的OD600 nm，以培养时间为横坐标，菌液OD600 nm为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.5  氯氰菊酯降解菌的鉴定

1）染色。常规染色观察菌株的形态学特征，革兰氏染色检测参照文献[6]。

2）16S rDNA序列系统发育分析。将菌体接种到富集培养基中培养过夜，取100 μL菌液离心，用灭菌水洗两遍，再用100 μL灭菌水悬浮菌体，沸水中煮10 min，再放置冰上5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清作为模板直接PCR。

PCR反应体系（25 μL）：rTaq 酶（5 U/μL） 0.2 μL，10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上清液 2 μL，上游引物 0.3 μL，下游引物 0.3 μL，灭菌水 17.7 μL。

PCR反应条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min30 s，30个循环;72 ℃ 8 min。

将PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，将条带单一，清晰的PCR产物切胶回收。将回收片段与pGEM–T Easy载体于4 ℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。随即挑取几个转化子抽提质粒，酶切检测。将含有目的条带的转化子送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

3）生理生化鉴定。为明确菌株的生理生化特性，对菌株作了以下试验：碳源利用试验，产酸试验，产H2S试验，淀粉水解试验，甲基红试验，明胶液化试验，V.P.试验，吲哚试验。试验方法参照文献[6]。

1.2.6  菌株对抗生素的敏感性  将菌株用富集培养基培养后，取10 μL接入含相应抗生素的LB培养基中，观察菌株在抗生素种类和浓度的敏感性。其中，抗生素的浓度分别为氨苄青霉素60 、20、10 μg/mL;卡那霉素50、10、2 μg/mL;链霉素50、10、2 μg/mL;氯霉素100、25、5 μg/mL。

2  结果与分析

2.1  氯氰菊酯降解菌的筛选

从生产氯氰菊酯的工厂附近采集样品，以氯氰菊酯为惟一碳源、氮源筛选具有降解农药能力的微生物。通过在含有氯氰菊酯的无机盐培养基中反复驯化以及无机盐平板上多次划线分离、纯化，初步得到9株降解氯氰菊酯的菌株。为维持降解菌降解能力的稳定性，后经进一步的复筛，将筛选得到的9株降解菌经过扩大培养、涂布含氯氰菊酯的无机盐平板，得到3株生长良好的降解菌。经紫外扫描分析，氯氰菊酯在278 nm处有最大吸收峰，确定一株高效降解氯氰菊酯的菌株，命名为DZS-3。图1为3 d内菌株DZS-3对氯氰菊酯降解情况及对照的紫外扫描图。

2.2  DZS-3对氯氰菊酯的降解率及降解趋势

氯氰菊酯降解率=[1-（实测残量/对照样实测残量）]×100%[7]。

气相色谱的灵敏度较高，为精确计算高效降解菌DZS-3的降解率，实验室用气相色谱检测了氯氰菊酯的含量。氯氰菊酯经DZS-3作用3 d后，DZS-3对氯氰菊酯的降解率为65.7%。图2为经气相色谱检测，DZS-39在9 d内对氯氰菊酯的降解情况。

由图2可以看出，前3 d DZS-3对氯氰菊酯的降解速率较快，3 d后降解逐渐变缓慢。可能是氯氰菊酯在降解的过程中产生了对其自身降解有抑制作用的中间产物。

2.3  高效降解菌生长曲线

该菌体的生长曲线（图3）与常规的生长曲线不同，一般生长曲线包括滞后期、指数期、稳定期和衰退期，而该菌的生长曲线没有稳定期。可能是氯氰菊酯在降解的过程中产生了某些严重抑制DZS-3生长的代谢产物，使菌体细胞迅速死亡裂解。

2.4  氯氰菊酯降解菌的鉴定

2.4.1  氯氰菊酯降解菌DZS-3的形态特征  通过简单染色、革兰氏染色等生物学技术初步鉴定DZS-3降解菌的形态特征。菌落为针尖状，表面光滑，无颜色，有轻微的气味，显微镜下形状呈短杆状。经革兰氏染色鉴定，DZS-3为革兰氏阴性菌。

2.4.2  16S rDNA同源性比较  为了确定降解菌的种类，采用比较常用的分类学指标——16S rDNA序列同源性比较。

通过菌落PCR扩增16S rDNA，扩增产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小如图4所示。将扩增得到的16S rDNA片段的测序结果与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行对比，菌株DZS-3与嗜麦芽寡养单胞菌PSM-2的16S rDNA一致性达到99%，将其初步鉴定为寡养单胞菌属的一种。

应用序列比对软件ClustalX 1.8软件对菌株的16S rDNA序列与相似性较高的16S rDNA序列进行比对，用系统发育分析软件Mega 5.03构建系统发育树，DZS-3系统发育进化树见图5。

2.4.3  DZS-3生理生化特性  DZS-3生理生化实验结果见表1。表1结果与嗜麦芽寡养单胞菌的模式菌株ATCC13637的特性除少数不同外基本上一致，模式菌株不能产酸，可以液化明胶，DZS-3可以产酸但不能液化明胶。

2.5  菌株对抗生素的敏感性

为明确DZS-3对各种抗生素的敏感性，对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等4种抗生素做了抗性试验。每种抗生素做了3个不同浓度梯度， DZS-3在加有不同浓度抗生素氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素的LB培养基中均表现出良好的生长状态，但是在氯霉素中不能生长。表明DZS-3在试验浓度内对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素都有抗性，对氯霉素敏感。由于DZS-3对多种抗生素具有抗性，这将影响其以后在环境中释放和应用。

3  讨论

氯氰菊酯在水中的溶解度非常低（大约0.1 mg/L），所以氯氰菊酯在使用前通常将其溶解在有机溶剂（如乙醇、正己烷）中以增加其溶解度。在筛选降解菌的过程中为防止筛选到的降解菌利用溶剂为碳源、氮源生长，采用乙醇和正己烷交替使用。通过反复的初筛和复筛，从生产氯氰菊酯的农药厂污水曝气处理池活性污泥中分离筛选一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3，通过气相色谱分析其3 d内对10 mg/L的氯氰菊酯的降解率为65.7%。经形态学研究及革兰氏染色，该菌属于革兰氏阴性菌，菌落为针尖状，表面光滑，显微镜下呈短杆状。经16S rDNA序列同源性分析及生理生化特性鉴定，将其鉴定为寡养单胞菌属的一种。

在对降解菌初筛时，采用紫外-可见分光光度法测定氯氰菊酯的含量，以氯仿为萃取剂，而氯仿本身对细胞膜有一定的破坏作用，在氯仿的作用下导致降解菌DZS-3细胞膜的破损，细胞内容物如蛋白质等渗透出来，被氯仿萃取出来，同时蛋白质的特征吸收峰在280 nm，与氯氰菊酯的特征吸收峰278 nm靠得很近，蛋白质的存在可能会影响氯氰菊酯的特征吸收，故使用分光光度仪只能粗略判定氯氰菊酯的降解情况。气相色谱灵敏度较高，测定的数据能真实反映物质的含量，要精确计算氯氰菊酯的降解率需采用气相色谱法准确测定氯氰菊酯的含量。

国内报道的氯氰菊酯降解菌株主要有红球菌（Rhodococcus sp.）[5]，假单胞菌（Pseudomonas sp.）[8，9，10，11]，肠杆菌Enterobacter sp.[9]，中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）[12]，克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[13]，芽孢杆菌（Bacillius sp.）[14]，产碱菌（Alcaligenes sp.）[15]，Starkeya sp.[16]，苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）[17]。国外报道的氯氰菊酯的降解菌株Pseudomonas sp.和Serratia sp. 20 d的降解率只有50%[18]，明显低于本研究分离的菌株DZS-3，分离筛选的这株菌属于寡养单胞菌属，大多属于不可培养微生物，与上述各个实验室报道的氯氰菊酯降解菌不同。菌株DZS-3对多种抗生素具有抗性，所以不能直接释放入环境用于污染环境的修复，但可以作为出发菌株研究氯氰菊酯降解相关酶基因，并且有可能克隆得到新的降解基因。

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