酒石酸长春质碱与DNA相互作用的光谱研究

刘 炜，张琼梅，史载锋，何文英

（海南师范大学 化学与化工学院，海口 571158）

酒石酸长春质碱与DNA相互作用的光谱研究

刘 炜＊，张琼梅，史载锋，何文英

（海南师范大学 化学与化工学院，海口 571158）

应用荧光光谱法、紫外光谱法和荧光探针研究了酒石酸长春质碱和鲱鱼精DNA分子间的相互作用.在pH为7.4的Tris－HCl缓冲溶液体系中，DNA对酒石酸长春质碱产生了较强的荧光猝灭作用，其猝灭机制判断为静态猝灭.计算了25℃和40℃两个不同温度下酒石酸长春质碱与DNA的结合常数分别为5.38×104和5.85×102，结合位点数分别为1.405和0.8306.根据两个温度下的结合常数计算出酒石酸长春质碱与DNA反应的热力学参数ΔHm＝－233.77kJ·mol－1，ΔGm（298K）＝－27.0kJ·mol－1，ΔSm（298K）＝－693.8J·K－1·mol－1，根据热力学参数确定了酒石酸长春质碱与DNA之间的作用力以氢键和范德华力为主.紫外光谱实验结果表明，随着DNA浓度的增大，酒石酸长春质碱的紫外吸收峰发生显著降低和蓝移，结合荧光探针实验进一步证明酒石酸长春质碱是以沟槽结合的方式与DNA结合.

酒石酸长春质碱；DNA；相互作用；光谱

核酸是重要的生命物质基础，对生物的生长、发育和繁殖等有重要作用.一些药物分子与DNA的相互作用会影响到DNA的生理和物理化学性质，改变DNA的转录和复制.DNA与靶向分子相互作用的研究不仅可以阐述一些抗肿瘤、抗病毒药物以及致癌物的作用机理，而且对进一步指导新型药物的设计合成研究都具有重要意义［1-2］.

图1 酒石酸长春质碱结构式Fig.1 The structure of catharanthine tartrate

酒石酸长春质碱为夹竹桃科植物长春花中提取的一种生物碱（图1为其结构式），目前尚未见有关其与DNA相互作用的研究报道.本文主要研究酒石酸长春质碱与DNA相互作用的机理，获得酒石酸长春质碱与DNA相互作用的信息，包括反应的结合常数、结合位点数、热力学参数以及结合方式等，为研究酒石酸长春质碱的药理提供了重要信息.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RF－5301荧光分光光度仪（Shimadzu，日本）；TU－1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；PHSJ－4A型pH计（上海精密科学仪器公司）；鲱鱼精DNA（sigma，美国）；酒石酸长春质碱（海南希源化工有限公司，纯度＞98%）；其它所用试剂均为分析纯试剂，实验用水均为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

在一系列10mL比色管中，依次加入1mL pH 7.4的Tris－HCl缓冲溶液，固定量的酒石酸长春质碱溶液和不同量的DNA溶液，并用二次蒸馏水稀释到刻度，摇匀，在荧光仪上进行荧光光谱和吸收光谱的测定.荧光激发波长选择280nm，狭缝宽度均为5nm.

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根据静态猝灭公式

2 结果与讨论

2.1 DNA对酒石酸长春质碱荧光光谱的影响

图2为pH 7.4tris－HCl缓冲液中DNA存在下酒石酸长春质碱的荧光发射光谱.从图2中可以看出，酒石酸长春质碱在357nm处有一最大发射峰，DNA存在可使酒石酸长春质碱357nm处的荧光发射强度发生猝灭，随着DNA浓度增大猝灭程度逐渐增强，表明DNA和酒石酸长春质碱可能形成了复合物.荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭2大类，根据猝灭Stern－Volumer方程

图2 DNA存在下酒石酸长春质碱的荧光发射光谱Fig.2 The fluorescence emission spectra of catharanthine tartrate in the presence of DNA

图3为pH 7.4tris－HCl缓冲液中DNA存在下酒石酸长春质碱的紫外吸收光谱.从图3中可以看出，酒石酸长春质碱在280nm处有一紫外吸收峰，随着DNA浓度的增大，酒石酸长春质碱的紫外吸收峰发生显著降低和蓝移，由于有机分子与DNA以嵌入或沟槽方式结合时会导致有机分子的紫外吸收峰强度发生升高或降低，同时最大吸收峰波长会发生蓝移或红移［7-9］，因此酒石酸长春质碱与DNA可能是以嵌入或沟槽的方式结合.

2.2 DNA对酒石酸长春质碱紫外吸收光谱的影响

F0与F分别代表总的和游离态的药物的荧光强度，τ0为猝灭剂不存在时物质的荧光寿命，［Q］为猝灭剂的平衡浓度.可计算出猝灭常数KSV＝1601L·mol－1，由于生物大分子的荧光平均寿命大约为10－8s［4］，因此可算出相应的双分子猝灭过程速率常数Kq＝1.60×1011L·mol－1·S－1，远大于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭速率常数（Kq＝2.0×1010L·mol－1·s－1）［5-6］，证明酒石酸长春质碱对BR－DNA体系的猝灭属于静态猝灭.

图3 DNA存在下酒石酸长春质碱的紫外吸收光谱Fig.3 The UV absorption spectra of catharanthine tartrate in the presence of DNA

2.3 DNA与酒石酸长春质碱二元络合物的组成及其结合常数

在一系列10mL比色管中，依次加入1mLpH 7.4的Tris－HCl缓冲溶液，固定量的盐酸小檗碱溶液、DNA溶液和不同量的酒石酸长春质碱溶液，再用二次蒸馏水稀释到刻度，摇匀，在荧光仪上进行荧光光谱测定.荧光激发波长选择358nm，狭缝宽度均为5nm.

根据药物小分子与生物大分子作用的有关热力学参数可以简单判断其相互作用类型［11］：若ΔH ＞0及ΔS＞0则主要表现为疏水作用，ΔH＜0及ΔS＞0主要表现为静电作用，ΔH＜0及ΔS＜0主要表现氢键或者范德华作用.

图4 25℃（a）和40℃（b）时DNA和酒石酸长春质碱反应的结合常数及结合位点数Fig.4 The binding constant and binding sites number of the interaction between catharanthine tartrate and DNA at 25℃（a）and 40℃（b）.

2.4 酒石酸长春质碱与DNA结合反应的热力学性质及作用力

根据酒石酸长春质碱与DNA的结合常数K1（298K）＝5.38 ×104，K2（313K）＝5.85 ×102，按式（3）～（5）可以求得二者结合过程的热力学函数：ΔHm＝－233.77kJ·mol－1，ΔGm（298K）＝－27.0kJ·mol－1，ΔSm（298K）＝－693.8J·K－1·mol－1，由此可初步判断酒石酸长春质碱与DNA间是以氢键或者范德华作用力结合为主.

F0与F分别代表总的和游离态的药物的荧光强度，K为酒石酸长春质碱与猝灭剂之间的结合常数，c为猝灭剂的平衡浓度，n为结合位点数，由式（2）分别作出不同温度下酒石酸长春质碱－DNA体系的关系图，结果如图4，通过斜率和外推截距可以求出酒石酸长春质碱与猝灭剂之间的结合常数和结合位点数.由图4可知，25℃时酒石酸长春质碱与DNA之间的结合常数为5.38×104，结合位点数为1.405，线性相关系数为0.9930；40℃时酒石酸长春质碱与DNA之间的结合常数为5.85×102，结合位点数为0.8306，线性相关系数为0.9947.

暂不考虑总重，为了平衡跨中的活载，同前，当预应力度分别取为1和0.5时得到的剪力滞系数沿着跨径方向的变化曲线如图10所示。

药物小分子与生物大分子的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等，药物不同，与DNA作用力类型也不同.当温度变化不大时，反应的焓变可视作常数，根据热力学公式可以计算药物小分子与生物大分子作用间的有关热力学参数：

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2.5 酒石酸长春质碱对小檗碱－DNA体系荧光强度影响的研究

盐酸小檗碱（BR）是以治疗肠道痢疾而著称的黄连素，可以专一性地插入DNA双螺旋的碱基对之间，使本身很弱的荧光得到显著性增强，当盐酸小檗碱从双螺旋中出来时，荧光又显著性降低，因此可作为荧光探针研究DNA与小分子化合物的相互作用［12-13］.若酒石酸长春质碱和 DNA 是以嵌入的方式结合，则酒石酸长春质碱可与BR竞争DNA的结合位点，将BR从DNA分子中挤出，从而使BR－DNA体系的荧光强度（λex＝358nm，λem＝530nm）降低.实验结果表明，随着酒石酸长春质碱浓度的增大，BR－DNA体系荧光强度基本不变，说明了酒石酸长春质碱与DNA之间不是嵌入结合.

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2.6 作用机理探讨

小分子探针与双螺旋DNA结合方式主要包括静电式、嵌入式和沟槽式3种模式.根据荧光探针实验，酒石酸长春质碱对BR－DNA体系荧光强度不产生猝灭作用，证明酒石酸长春质碱与DNA不是嵌入式结合；结合酒石酸长春质碱和DNA反应的紫外吸收谱图，说明长春碱与DNA应该是以沟槽结合的方式相互作用.

［1］吴会灵，杨芃原，张重杰，等.小分子与核酸相互作用的研究进展［J］.分析化学，2004，32（9）：1256－1261.

［2］李 静，李景印，郭玉凤.生物小分子与DNA相互作用的光谱及电化学研究进展［J］.化学研究，2005，16（4）：101－104.

［3］Eftink M R，Ghiron C A.Fluorescence quenching studies with proteins［J］.Anal Biochem，1981，114：199－227.

［4］肖厚荣，盛良全，施春华.水杨酸与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究［J］.光谱学与光谱分析，2004，24（1）：78－81.

［5］Kandagal P B，Seetharamappa J，Shaikh S M T，et al.Binding of trazodone hydrochloride with human serum albumin：A spectroscopic study［J］.J Photochem Photobiol A，2007，185：239－244.

［6］邓胜国，邓泽元，范亚苇，等.荷叶中紫云英苷和DNA相互作用的光谱学研究［J］.光谱学与光谱分析，2010，30（2）：476－480.

［7］Kumar C V，Asuncion H E.DNA binding studies and site selective fluoscence sensitization of an anthryl probe［J］.J Am Chem Soc，1993，115：8547－8553.

［8］刘 炜，杨丽珠，蒋丽萍，等.Ca－ALC络合物和鱼精子DNA反应的电化学与光谱研究［J］.华中师范大学学报：自然科学版，2005，39（1）：79－83.

［9］刘 炜，张琼梅，毕和平.硫酸长春碱与DNA相互作用的机理研究［J］.海南师范大学学报：自然科学版，2010，23（4）：403－406.

［10］Kandagal P B，Ashoka S，Seetharamappa J，et al.Study of the interaction of an anticancer drug with human and bovine serum albumin：spectroscopic approach［J］.J Pharm Biomed Anal，2006，41（2）：393－399.

［11］Ross D P，Sabramania N S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20：3096－3102.

［12］贺吉香，江崇球，高明霞，等.盐酸小檗碱与脱氧核糖核酸相互作用的研究［J］.光谱学与光谱分析，2003，23（4）：755－758.

［13］沈景山，孙丹丹，付连春，等.荧光光谱法研究抗癌药物与DNA的相互作用［J］.光谱学与光谱分析，2005，25（2）：232－234.

Study on the interaction between catharanthine tartrate and DNA by spectrometric method

LIU Wei，ZHANG Qiongmei，SHI Zaifeng，HE Wenying
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158）

The interaction of catharanthine tartrate and DNA was studied using UV spectrometry，fluorescence spectrometry and fluorescent probe.The results showed that the fluorescence intensity of catharanthine tartrate was quenched in the presence of DNA，and this mechanism was judged as static quenching.The binding constant Kat 25℃and 40℃ were calculated as 5.38×104and 5.85×102，and the binding sites number nas 1.405and 0.8306.According to the binding constant Kat 25℃and 40℃，the thermodynamic parameters of the reaction of catharanthine tartrate and DNA were calculated as follows：ΔHm＝－233.77kJ·mol－1，ΔGm（298K）＝－27.0kJ·mol－1，ΔSm（298K）＝－693.8J·K－1·mol－1，and the main binding force between catharanthine tartrate and DNA is hydrogen bonding or van der Waals force according to thermodynamic parameters.The UV spectrometry test showed that as the DNA concentration increased，the blue shift of the absorbance peak occured and the absorbance decreased significantly，the results of fluorescence probe test further proved that catharanthine tartrate binds with DNA in a mode of groove binding.

catharanthine tartrate；DNA；interaction；spectrometry

O657.32

A

1000－1190（2011）04－0595－04

2011－07－16.

海南省教育厅项目（Hjkj2009－39）；海南省自然科学基金项目（209004）.

＊E－mail：liuwei1224＠126.com.