利用常染色体 STR多态性进行同胞鉴定 5例＊

宋丽君,郭嘉林,陈 辉,周军卫,李晓文#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室郑州 450001 2)漯河医学高等专科学校生物学教研室漯河 462000 #通讯作者,女,1955年 8月生,教授,研究方向:遗传病的分子机制与基因诊断

利用常染色体 STR多态性进行同胞鉴定 5例＊

宋丽君1),郭嘉林2),陈 辉1),周军卫1),李晓文1)#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室郑州 450001 2)漯河医学高等专科学校生物学教研室漯河 462000 #通讯作者,女,1955年 8月生,教授,研究方向:遗传病的分子机制与基因诊断

同胞鉴定;常染色体;短串联重复序列;复合扩增

目前可应用于亲缘关系鉴定的检测技术手段有染色体短串联重复序列 (STR)、单核苷酸多态性(SNP)分析及线粒体测序等。Y-STR呈父系连锁遗传,仅适用于男性间的鉴别;SNP检测技术方法复杂,费用昂贵;线粒体 DNA存在高突变率和异质性[1],因此,实际应用受限。常染色体 STR具有多态性高、分型简便、检出灵敏度高及特异性好等特点,且可进行多位点复合扩增,目前已成为国内外DNA亲子鉴定的主要检测手段。作者对 5个同胞鉴定案例进行常染色体 STR检测,采用无双亲来源等位基因排除和全相同/全不同基因座数排除相结合的方法,探讨常染色体 STR多态性位点用于同胞亲缘关系鉴定的可行性及应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象 寻亲个体 E1和 E2为两名中年男性,均自幼由上海抱养至河南,因外表相似常被错认,因此要求进行同胞兄弟鉴定;寻亲个体 Ax、Bx、Cx和Dx分别有 2(A1、A2)、3(B1、B2、B3)、3(C1、C2、C3)及 3(D1、D2、D3)名已知同胞。经知情同意,抽取以上检测对象的静脉血各 2 mL,EDTA抗凝。

1.2 STR多态性位点 PCR复合扩增[1-2]酚-氯仿法提取受试者基因组DNA,扩增24个常染色体 STR位点:CSF1PO、TPOX、THO1、F13A01、D7S3048、v WA、D7S820、D13S317、D16S539、D11S2368、D12S391、D4S2639、D18S51、D16S3253、D3S1358、D19S253、D14S306、D18S535、D21S11、D2S1338、D8S1132、D22S684、D8S1179及D5S818,E1和 E2除上述 24个位点外,加测 D3S1359、PAH、FGA、D15S659、D21S215、D159817、D1S1656及 FESFPS位点。引物序列均来源于 GenBank,由上海生工生物工程公司合成。在离心管中加入Mix 10μL(上海莱枫生物科技有限公司),DNA 1.7μL,复合引物终浓度 1 nmol/L,ddH2O补充至 20μL。扩增条件:96℃预变性 2 min;94℃变性 1 min,60℃退火 1 min, 70℃延伸 1.5 min,10个循环;90℃1 min,60℃1 min,70℃1.5 min,20个循环;60℃延伸 30 min;4℃保持。60 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据电泳结果进行基因分型。

2 结果

寻亲个体 E1和 E2的 32个常染色体 STR位点基因分型结果完全一致。

在A、B、C、D 4个案例中,通过已知同胞基因型反推双亲的 4个等位基因,4个寻亲个体分别有 2、9、6、8个基因位点的等位基因与双亲等位基因不符,见表 1;A、B、C、D案例中寻亲个体与已知同胞间等位基因全相同与全不同的情况见表 2。

表1 无双亲来源的常染色体 STR位点分析

表2 无双亲来源的常染色体等位基因的匹配情况

3 讨论

常染色体 STR为共显性遗传,不受性别的限制。在日常工作中,更适用于对缺乏双亲遗传信息的同胞亲缘关系进行鉴定,但需要提供较多的已知同胞个体数目,同时检测较多的基因位点数目。

根据已知同胞的基因型,可反推其双亲的等位基因,从而对待定个体进行判别。德国亲子鉴定专家协会认为,若待定个体有 3个或 3个以上基因位点出现双亲无法提供的等位基因时,即可排除其亲权关系[3]。该研究中寻亲个体Bx、Cx、Dx与对应的已知同胞推测双亲不符的基因位点分别有 9个、6个和8个,均可排除其与已知同胞的亲缘关系。但案例A中只有两个已知同胞个体,大多位点不能推断其双亲的基因型,仅在D4S2639和D8S1132两个位点检出排除同胞关系的等位基因,因此难以对寻亲个体Ax的亲缘关系进行判定。可见,通过子代基因反推双亲的等位基因来进行同胞亲缘关系判定,只有在同胞人数较多 (≥3)时,选用足够多的常染色体 STR位点才能够得到较多的遗传信息,从而获得较为准确的鉴定结果。

按照孟德尔遗传定律,子代半数基因来自父方,半数基因来自母方。因此子代同胞间的基因型可能为 1/4全相同、1/2半相同或 1/4全不同。该课题组前期实验[1]结果表明,在 24个常染色体 STR基因座中,当两个体全相同基因座数≥8,或全不同基因座≤2时,提示为同胞关系;当两个体全不同基因座数≥9,或全相同基因座≤1时,提示为无关个体。依据以上判定方法,寻亲个体 E1和 E2在 32个常染色体 STR位点上的基因型完全相同,可判定为同卵双生兄弟。案例 A中寻亲个体与两名同胞个体间全相同和全不同基因座数分别为 1、2和 7、13,可排除同胞关系;案例B中寻亲个体与三名已知同胞全不同基因座数为9、9、12,可排除同胞关系;案例C和案例D中寻亲个体与三名已知同胞之间全相同和全不同基因座数分别均为 2、4、2和 10、8、12,依据上述判定方法不能排除同胞关系。

A、B、C、D四个案例若分别采用上述两种方法,均不能全部进行亲缘关系的判断,但两种方法相结合,4个同胞亲缘关系鉴定案例均可排除寻亲个体与已知同胞的亲缘关系。

此外,相对于国内外应用较多的AB IAmpFISTR Profiler、AB I AmpFISTR Identifier、AmpF/STR和Power PlexT M16等试剂盒[4-6],作者采用实验室自行设计的多位点复合扩增体系,可大幅降低实验成本;同时,应用 STR等位基因无双亲来源排除法和全相同/全不同基因座数计算法相结合对同胞亲缘关系进行判定,比 ITO等公式计算方法更加简便快捷,同时不受基因座等位基因频率的影响,适宜在日常鉴定中推广应用。

[1]孙莉.河南汉族 STR遗传多态性及其在同胞鉴定中的应用[D].郑州:郑州大学,2006.

[2]萨姆布鲁克.分子克隆试验指南 [M].金冬雁译.北京:科学出版社,1992:956

[3]庞玲霞,申屠杨萍,吴淑珍.利用 STR基因座多态性鉴定同胞亲缘关系二例[J].中国优生与遗传杂志,2008, 16(8):37

[4]Gaytmenn R,Hildebrand DP,SweetD,et al.Determination of the sensitivity and specificity of sibship calculations using AmpF1STR Profiler Plus[J]. Int J Legal Med, 2002,116(3):161

[5]Reid T M,Wolf CA,Kraemer CM,et al.Specificity of sibship determination using the AB I Identifiler multiplex system[J].J Forensic Sci,2004,49(6):1 262

[6]陸惠玲,周科伟,吕德坚,等.IT O法和判别函数法在同胞关系鉴定中的应用[J].法医学杂志,2009,35(2):118

＊国家自然科学基金资助项目 30700966

(2009-11-26收稿 责任编辑徐春燕)