杜氏盐藻 cDNA文库的构建及 KCBP基因的克隆＊

柳丽平,李 杰,王 翠,阎赟梦,薛乐勋

郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001

杜氏盐藻 cDNA文库的构建及 KCBP基因的克隆＊

柳丽平,李 杰,王 翠,阎赟梦,薛乐勋#

郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001

#通讯作者,男,1944年 2月生,研究员,研究方向:生物工程,E-mail:xuelx@371.net

杜氏盐藻;cDNA文库;类驱动蛋白钙调素结合蛋白

目的:构建杜氏盐藻 cDNA文库并从该文库中筛选类驱动蛋白钙调素结合蛋白 (KCBP)基因 cDNA序列。方法:取对数生长期的杜氏盐藻细胞,提取总 RNA并分离纯化 mRNA,反转录合成双链 cDNA,连接到 pAP3neo载体上,采用电转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH10B。计算平板上单菌落数,测定文库的滴定度和重组率。运用 PCR法筛选含有 KCBP基因特异片段的质粒。结果:文库滴定度为 5.6×106pfu/mL,重组率在 90%左右,插入片段长度在 0.4～6.0 kb,平均长度为 1.9 kb。利用 PCR法从该文库中筛选到了含有新基因 KCBP特异片段的单菌落,经测序与 cDNA末端快速扩增 (RACE)-PCR获得的杜氏盐藻 KCBP基因 cDNA序列相符,此序列属于 kinesin-14家族。结论:成功构建杜氏盐藻 cDNA文库,并从该文库筛选出一个kinesin样 cDNA序列。

运用藻类基因工程手段可以构建高产、优质、抗逆的藻类新品种,生产燃料、降解污染物[1]以及构建藻类表达系统以生产大量廉价的蛋白和药物来研究并治疗人类疾病。作为单细胞生物的杜氏盐藻具有没有细胞壁、培养条件简单等许多独特优点[2-3],这使它不但可以作为一种新型的生物反应器宿主,而且可以作为模式生物用于对其他物种基因工程表达调控等方面的研究。cDNA文库包含了生物体表达的全部基因信息,是获取未知功能基因的有效技术手段,也是系统研究生物基因结构和功能的基础[4]。构建杜氏盐藻 cDNA文库,可用于筛选相关目的基因,在克隆新基因以及基因功能分析研究等方面发挥重要作用,更有利于利用基因工程技术对杜氏盐藻进行改造来生产所需的外源性蛋白。作者构建了杜氏盐藻 cDNA文库并从中筛选到类驱动蛋白样钙调素结合蛋白(kinase like calmodulin-binding protein,KCBP)基因,获得该基因的 cDNA序列全长。

1 材料与方法

1.1 材料 该实验室培养的处于对数生长期的新鲜杜氏盐藻,Trizol细胞裂解液购自 Promega公司,Mag-Bind mRNA纯化试剂盒购自美国 OMEGA公司,cDNA文库构建试剂盒购自大连宝生物公司,5’-RACE和 3’-RACE试剂盒购自美国 Ambion公司,其他常规试剂均为分析纯。

1.2 cDNA文库的构建 取 200 mL处于对数生长期的杜氏盐藻细胞,用 Trizol法提取总 RNA,用乙醇和高浓度冰冷的氯化钠沉淀分离所得的总 RNA,用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测其质量,并用分光光度计测量其纯度,用Mag-Bind mRNA试剂盒分离纯化 mRNA。用M-MLV RTase合成双链 cDNA,取 0.5μL用 10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测双链 cDNA的质量。按照试剂盒要求,每 12.5μL cDNA溶液用 3.5μLEcoR I-Sm aI Adaptor(0.4 g/L)、10 ×T4 DNA Ligase Buffer 2μL 、T4 DNA Ligase(350 U/μL)2μL混匀后 8℃过夜反应 (16 h以上),加入NotⅠ27μL、EcoRⅠ (50 U/μL)3μL混匀 ,37 ℃反应 3 h使 cDNA末端平滑化;用层析柱除去小于 400 bp的短链 cDNA,然后与 pAP3neo载体连接并电转化到大肠杆菌DH10B感受态细胞中。

1.3 文库质量鉴定 计算平板上单菌落数,测定文库的滴定度和重组率。随机挑取 13个单菌落,用试剂盒中的 T3(5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3’)和 T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)引物进行 PCR扩增,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。PCR扩增程序:95℃预变性 1min;94℃变性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 3min,30个循环;72℃延伸 10min,4℃停止。

1.4 兼并引物的设计与 RACE法扩增 KCBP基因从 GenBank上搜索已登录的 KCBP氨基酸序列并进行序列比对,根据其在莱茵衣藻、绿藻等物种中的保守性,找出两段保守性高、兼并性低的序列 D IMQFG和 CIFAYG,设计一对兼并引物 F30[5’-GA(T/C)AT(T/C/A)ATGCA(A/G)TT(T/C)GG-3’]和 R30[5’-CC(A/G)TA(A/C/G/T)GC(A/G)AA(A/G/T)AT(A/G)CA-3’],引物由北京博尚生物工程公司合成。提取对数期杜氏盐藻总 RNA,反转录 cDNA,RT-PCR扩增得到 KCBP片段,使用 RACE试剂盒扩增得到 KCBP 3’端与 5’端序列,经拼接得到KCBP基因全长。

1.5 cDNA文库的快速筛选 挑取 10个转化子单菌落为一组,接种到一个含有氨苄青霉素的 LB培养基试管中,培养 8 h。5管约 50个转化子为一个转化子池,每管取 100μL培养物混合,收集菌体并提取质粒,溶于 100μL dH2O中。取 0.5μL质粒用引物F30、R30进行 KCBP基因的特异 PCR检测。筛选出阳性转化子池,然后再对阳性转化子池中的单个转化子进行 PCR筛选,直至获得阳性转化子。将阳性转化子的菌液送北京博尚生物工程公司测序。

2 结果

2.1 总 RNA及双链 cDNA的质量 琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA:得到 28S和 18S两条清晰的条带,亮度大约是 2∶1。紫外分光光度计测定A(260 nm)/A(280 nm)为 1.98。双链 cDNA经 10 g/L琼脂糖凝胶检测,形成弥散条带,长度 0.1～3.0 kb(图1)。

图1 双链 cDNA电泳检测M:DL 10 kb;1:双链 cDNA。

2.2 文库滴定度 文库滴定度为 5.6×106pfu/mL,重组率在 90%左右。对随机挑取的克隆进行PCR扩增,经 10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小,结果得到 0.4～6.0 kb不等的片段 (图2),平均插入片段长度为 1.9 kb。

图2 随机挑取克隆的 PCR结果1～13:随机挑取的 13个克隆的 PCR产物;M:DL 10 kb。

2.3 兼并引物 PCR扩增 利用兼并引物进行 PCR反应获得了 1 350 bp的条带 (图3),测序后与其他物种比对,发现其与衣藻中 KCBP基因的同源性高达 83%,与其他物种也有 50%～80%的同源性,可认为得到盐藻 KCBP基因部分片段。

图3 兼并引物 PCR扩增产物M:DL 10 kb;1:PCR产物。

2.4 新基因的筛选 PCR法筛选阳性转化子池,出现 1 350 bp的目的条带;同时对阳性转化子池内的转化子再次进行 PCR,仍然出现目的条带的转化子为阳性转化子 (图4,5)。阳性转化子经测序,结果与通过 RACE-PCR扩增所得 KCBP基因全长 cDNA序列完全相符。该基因全长 4 514 bp,读码框长度为 3 816 bp,其中包含MyTH4结构域、FERM_M结构域和Motor结构域等。该序列已提交 Gen-Bank(登录号为 GU345802)。

3 讨论

构建高质量的 cDNA文库的基础和前提是提取到高质量的 mRNA。作者采用 Trizol法提取到了较为完整的mRNA。由于杜氏盐藻中富含多糖和酚类物质,它们易与 RNA结合,影响 RNA质量[5],因此常规 RNA提取结果均不是很理想。作者采用乙醇沉淀和高浓度冰冷的氯化钠双重沉淀后才进行 cDNA双链的合成,从而极大地降低了多糖和酚类物质的影响。同时,层析柱分级分离 cDNA也很关键,短片段过多会影响连接转化效果和文库质量。转化体系中所加入的目的片段不能超过 4.0μL,过多会导致转化效率降低。文库滴度、重组率和插入片段的大小是鉴定 cDNA文库质量的重要标准[6]。作者构建的文库滴定度为 5.6×106pfu/mL,重组率为 90%左右,插入片段的平均长度为 1.9 kb,这些数据完全满足了构建完整文库的要求,同时,从构建的文库中获得的 KCBP基因全长 cDNA序列,与 RACE-PCR所得序列完全相符,说明成功构建了杜氏盐藻 cDNA文库。

该文库中验证并筛选到的 KCBP为 kinesin-14家族的一个成员。Kinesin参与鞭毛微管的组装。KCBP在拟南芥中首次发现[7],它是唯一含有结合钙调素结构域的驱动蛋白。起初认为 KCBP仅存在于被子植物中,近来发现其同源物在裸子植物 (挪威云杉)和绿藻 (莱茵衣藻和杆形裂丝藻)中也存在。KCBP基因全长的克隆为研究其在杜氏盐藻鞭毛生长中的作用及其细胞内运输功能的作用机制奠定了基础。在绿藻的很多成员中细胞分裂的模式与开花植物不同,在胞质分裂期间藻膜体取代成膜体,在这些类群中 KCBP的存在提示其在藻膜体的形成中也起重要作用。在海胆中也报道过有一个KCBP存在[8],但是这个基因缺失 KCBP特有的MyTH4和类踝蛋白结构域。到目前为止,KCBP及其同源物在哺乳动物、真菌、果蝇或秀丽隐杆线虫中还没有发现[9]。因此,真正的 KCBP及其同源物仅出现在植物和绿藻中。

[1]冯书营,刘红涛,李杰,等.杜氏盐藻基因工程研究现状及应用前景[J].中国生物工程杂志,2007,27(2):108

[2]AvronM,Ben-AmotzA.Dunaliella:physiology,biochemistry and biotechnology[M].Florida:CRV Press,1992:150

[3]Walker TL,Purton S,Becker DK,et al.Mocroalgae as bioreactors[J].Plant Cell Rep,2005,24(11):629

[4]杨全,张卉,王文全,等.甘草根 cDNA文库构建与分析[J].中国中药杂志,2008,33(12):1 386

[5]Schneiderbauer AH,Sandermann H Jr,Ernst D.Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J].AnalBiochem,1991,197(1):91

[6]杨成君,王军,刘关君,等.红果人参叶中 cDNA文库的构建[J].植物生理学通讯,2007,43(4):664

[7]ReddyAS,Narasimhulu SB,Safadi F,et al.A plant kinesin heavy chain-like protein is a ca lmodulin-binding protein[J].Plant J,1996,10(1):9

[8]Rogers GC,Hart CL,Wedaman KP,et al.Identification of kinesin-C,a calmodulin-binding carboxy-terminal kinesin in animal(Strongylocentrotus purpuratus)cells[J].MolBiol,1999,294(1):1

[9]Abdel-Ghany SE,Day IS,S immonsMP,et al.Origin and evolution of kinesin-like calmodulin-binding protein[J].J Plant Physiol,2005,138(3):1 711

(2010-01-07收稿 责任编辑王 曼)

Construction of cDNA library ofDunaliella salinaand cloning of kinesin like calmodulin-binding protein gene

L IU L iping,L I Jie,WANG Cui,YAN Yunm eng,XUE Lexun
Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B ioengineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;cDNA library;kinesin like calmodulin-binding protein

A im:To construct the cDNA libraryofDunaliella salinaand clone a new gene,kinesin like calmodulin-binding protein(KCBP).Methods:Total RNA was isolated and purified fromDunaliella salina.cDNA was then synthesized fromisolated mRNA and ligated into the pAP3neo predigested vector.The recombinant plas midswere transformed intoEscherichia coliDH10B by electroporation.Then the titers and recombinant rateswere determined by the number of single clones.KCBP was screened from the cDNA plas mid library ofDunaliella salinaby PCR.Results:The titer of the cDNA librarywas 5.6×106pfu/mL,the recombination rate was about 90%,the sizes ofmost inserted fragments ranged from 0.4 to 6.0 kb with an average size of 1.9 kb.The screened gene KCBP belonges to kinesin-14 family.Conclusion:KCBP is cloned and screened successfully from the cDNA library ofDunaliella salinaconstructed in this study.

Q781

＊国家自然科学基金资助项目 30700014;科技部国际科技合作基金资助项目 2007DFA01240