黄芪总黄酮对K562细胞凋亡及细胞周期的影响

张冬青，汪德清，李 卉，吴亮亮

(解放军总医院1.输血科，2.肿瘤科，北京 100853)

白血病是严重危害人类健康的恶性肿瘤，儿童尤其多见。黄芪总黄酮(total flavonoids of Astragalus，TFA)是从蒙古黄芪中分离的抗氧化、清除自由基的主要活性成分［1，2］，系列研究表明TFA具有抗损伤、抗突变、抗肿瘤和抑制动脉粥样硬化等多种生物学效应［3～5］。本研究以人红白血病细胞株(K562)作为研究对象，采用MTT法检测了不同浓度TFA对K562细胞株的生长抑制作用，并研究其对K562细胞周期的作用，通过体外实验研究TFA的抗肿瘤活性，为黄芪提取物抗肿瘤实验的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 黄芪总黄酮(TFA)，解放军总医院生化科分离鉴定，高压消毒，以适量DMSO溶解后，加培养基稀释至所需浓度，四噻唑蓝(MTT)、AnnexinV-FITC和细胞周期试剂盒(凯基生物科技发展有限公司);10%新生牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco)。

1.2 MTT法检测TFA对K562细胞增殖的抑制作用

K562细胞按1×104个细胞/孔/100 μl接种于96孔板，加入10 μl不同浓度的TFA/同体积培养液，使终浓度分别为20、50、100和200 mg·L－1，每个浓度设 6个重复孔，并设溶剂对照孔，置37℃、5%CO2孵箱培养24 h后每孔加入MTT 20 μl，继续置37℃、5%CO2孵箱培养4 h，然后吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μl终止反应，混匀后于波长492 nm测定光密度值(OD)，然后计算癌细胞生长抑制率，计算公式:肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1－给药组A450/细胞对照组A450)×100%，半数抑制浓度(IC50)计算方法:用细胞存活率对剂量对数作图并按作图法求出IC50值。

1.3 Annexin V-FITC双染法检测TFA诱导K562细胞凋亡的作用 取对数生长期的K562细胞，以1×107·L－1个细胞的密度接种于25 ml培养瓶中，收集培养2、4、6、12和24 h的未加药组和加TFA组(100 mg·L－1)，标记Annexin V和PI后，上流式细胞仪检测，分析细胞凋亡比例。

1.4 细胞周期测定 25 cm2的培养瓶每瓶接种5×106细胞，加入TFA，药物浓度为其IC50，培养24 h后，用PBS洗涤细胞两次，2 000 r·min－1离心5 min，然后用 PBS完全吹悬细胞，用体积分数70%的乙醇固定，4℃固定48 h以上;染色前用 PBS洗去乙醇，2 000 r·min－1离心 5min，洗两遍，加100 μl RNase A 37℃水浴 30 min，再加入 400 μl PI染色混匀，4℃避光30 min，上流式细胞仪进行检测，分析细胞周期变化。根据公式计算细胞增殖指数〔PI%=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)〕。

2 结果

2.1 TFA对K562细胞增殖的抑制作用 TFA作用于K562细胞24、48和72 h后，在一定浓度范围内(20～200 mg·L－1)，随着药物浓度增加，细胞的抑制率与TFA浓度大小呈正相关，即样本浓度越高，对肿瘤细胞的抑制率越高，且在24、48和72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为98.63、87.90和 63.10 mg·L－1。

2.2 TFA对K562细胞凋亡的影响 在流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限显示早期凋亡细胞，右上象限是晚期凋亡及坏死细胞。TFA以100 mg·L－1处理K562细胞后，其凋亡率无明显变化(Tab 1)。

Tab 1The apoptotic effect of TFA on K562 cells(±s)

Tab 1The apoptotic effect of TFA on K562 cells(±s)

Treated hour Apoptotic plus necrotic cells/%Early apoptotic cells/%2 5.3±1.28 2.6±0.52 4 9.8±2.43 4.1±0.89 6 11.4±3.23 6.9±1.63 12 14.3±3.07 7.2±1.08 24 12.5±2.98 7.8±1.21

2.3 TFA对K562细胞周期的作用 K562细胞给药24 h，PI染色后使用流式细胞仪进行检测分析。经TFA(50，100 mg·L－1)处理24 h后，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少。

3 讨论

白血病K562细胞株是一个来源于人类慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)病人急变的红白血病细胞株。迄今化疗仍是白血病最重要和最基本的治疗手段，祖国传统医学对治疗白血病具有很强的临床优势，很多中药制剂都有明显疗效。黄芪是一味历史悠久、临床应用十分广泛的中药，具有免疫调节、抗病毒、抗氧化和抗突变等作用，并且能抑制小鼠肿瘤生长，许杜鹃等［6］发现黄芪总苷对小鼠移植性肝癌(HepA)和S180肉瘤的生长均有明显抑制作用，在体外亦可明显抑制HeLa细胞的生长。蒙古黄芪干燥根中分离纯化出的凝集素，发现其对K562细胞的增殖有抑制作用［7］。

实验研究表明黄芪总黄酮是黄芪中分离的抗氧化清除自由基的主要活性成分，能明显抑制红白血病细胞系K562细胞的生长，作用24 h后，显微镜下可见细胞明显减少，在实验所取剂量范围之内，随着TFA浓度的增大及作用时间的延长，其抑制效果明显增强，呈浓度和时间依赖关系。黄芪总黄酮对K562细胞作用24 h后，无明显的诱导凋亡的作用，但是黄芪总黄酮可以将K562细胞阻滞于G0/G1期。表明使细胞停滞于G1期，同时在TFA的作用下，S期的K562细胞明显减少，说明其增殖活性已有所减弱。因此，有必要对黄芪总黄酮的作用机制做深入的研究，以阐明药物在肿瘤细胞凋亡、分化、增殖抑制中的作用，探求其用于白血病治疗的可能性。

［1］汪德清，沈文梅，田亚平，等.黄芪的三种提取成分对氧自由基的作用［J］.中国药理学通报，1994，10(2):129－32.

［1］Wang D Q，Shen W M，Tian Y P.The effects of the three components isolated from astragalus mongholicus bunge on scavenging free radical［J］.Chin Pharmacol Bull，1994，10(2):129－ 32.

［2］汪德清，沈文梅，田亚平，等.黄芪有效成分对氧自由基清除作用的ESR研究［J］.生物化学与生物物理进展，1996，23(3):260－2.

［2］Wang D Q，Shen W M，Tian Y P.Scavenging effects of active principles from astragalus mongholicus bunge on oxygen free radicals studied by ESR［J］.Prog Biochem Biophys，1996，23(3):260－2.

［3］汪德清，田亚平，宋淑珍，等.黄芪总黄酮抗突变作用实验研究［J］.中国中药杂志，2003，28(12):1164－7.

［3］Wang D Q，Tian Y P，Song S Z.Anti-mutagenesis effects of total flavonoids of Astragalus［J］.China J Chin Mat Med，2003，28(12):1164－7.

［4］汪德清，李 煜，田亚平，等.黄芪总黄酮对BEL27402细胞的体外抑制作用［J］.军医进修学院学报，2005，26(5):331－3.

［4］Wang D Q，Li Y，Tian Y P.Inhibition effects of total flavonoids of a stragalus on BEL27402 cellin vitro［J］.Acad J PLA Postgr Med Sch，2005，26(5):331－3.

［5］汪德清，丁保国，Tomas Neil，等.黄芪总黄酮对动脉粥样硬化早期形成的影响［J］.中国药理学通报，2003，19(6):637－40.

［5］Wang D Q，Ding B G，Neil T.Effects of total flavonoids of astragalus on early atherosclerosis in rabbits with diet-induced hypercholesterolemia［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(6):637－40.

［6］许杜娟，吴 强，杨 雁，等.黄芪总苷的抑瘤作用及其作用机制［J］.中国药理学通报，2003，19(7):823－6.

［6］Xu D J，Wu Q，Yang Y.Antitumor activity of AST and its mechanism of action［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(7):823－6.

［7］李艳霞，闫巧娟，孙 艳，等.蒙古黄芪凝集素对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡［J］.中国药理学通报，2009，25(7):904－7.

［7］Li Y X，Yan Q J，Sun Y，et al.Antiproliferation and apoptosis of K562 cells by Astragalus Mongholicus Lectin［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):904－7.