姜黄素对大鼠缺血性脑损伤炎症反应和血脑屏障通透性的影响

2010-12-06雷军荣黄宽明周章明

中国药理学通报 2010年1期

雷军荣，秦军，张晶，黄宽明，付锐，周章明

(郧阳医学院附属太和医院，湖北十堰 442000)

脑血管病是危害人类生命和健康的常见病。脑缺血损伤所涉及的病理生理机制十分复杂，其中，炎症反应和血脑屏障破坏均是缺血性脑损伤的重要病理生理机制［1］。研究表明［2］肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在脑缺血诱导的炎症反应中起着重要的作用;基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在脑缺血诱导的血脑屏障破坏中起着重要的作用［3］。国内外研究［4，5］证实姜黄素对脑缺血损伤具有脑保护作用，但是姜黄素对炎症反应和TNF-α作用的相关研究较少，本实验对姜黄素影响血脑屏障通透性和MMP-9表达进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 药物和主要试剂姜黄素，购自美国Sigma公司，分子量 368.38，用 0.5 mol·L－1NaOH 溶解，然后立即用PBS稀释成100 g·L－1，储存于－20℃，用时根据需要量再进行稀释。

伊文思蓝染料和TTC染料购自美国Amersco公司。MPO检测试剂盒购自南京建成生物技术公司。TNF-α ELISA试剂盒购自美国RD公司。兔抗大鼠MMP-9多克隆抗体购自美国 Santa Cruz公司。Western blot试剂盒购自美国KPL公司。

1.2 动物分组及脑缺血模型的制备 ♂清洁级Sprague-Dawley大鼠，体重(250±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供［许可证号:SCXK(沪)2003－0003］。随机将大鼠分为4个组，即假手术组、溶媒组、姜黄素10 mg·kg－1组和姜黄素50 mg·kg－1组。脑缺血2 h后，经腹腔注射给予药物或溶媒(PBS)，只给1次。

根据Longa线栓法［6］加以改进，采用直径0.32 mm的尼龙鱼线，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎颈外动脉。在颈外动脉近分叉处剪一“V”形切口，插入备用鱼线，用镊子轻轻将栓线送至大脑中动脉起始处，平均进线18.0±2.0 mm(距离颈总动脉分叉点)，固定栓线，2 h后拔除栓线制备再灌注损伤模型。假手术组只分离血管，不插入尼龙线。

1.3 神经功能损伤评分根据文献报道的神经功能损伤评分方法［7］，对脑缺血后24 h的大鼠进行神经功能评分。没有神经功能障碍者，0分;提起大鼠尾巴对侧前肢屈曲者，1分;行走时地上打转，静止时身体无偏向对侧者，2分;行走时地上打转，静止时身体也偏向对侧者，3分;严重意识障碍者，4分。

1.4 脑梗死体积测定脑缺血后24 h，处死大鼠，快速取出大脑，沿冠状面将大脑进行切片，每片厚度2 mm，放在2%TTC溶液中避光孵育20 min。孵育完毕后，将脑片置10%福尔马林中固定24 h。正常脑组织呈鲜红色，梗死脑组织呈白色。利用IPP软件测量各脑片梗死面积，并计算整个大脑梗死体积。

1.5 测定中性粒细胞浸润脑组织的程度髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞的标志性物质，通过检测MPO的活性可知中性粒细胞的浸润程度。在相应缺血时点取大鼠缺血脑组织，匀浆，按试剂盒说明书步骤操作，并计算MPO活性。

1.6 大脑伊文思蓝含量测定脑缺血23 h后，经股静脉注射2%伊文思蓝溶液1 ml，数秒钟后可见大鼠眼睛、皮肤变成蓝色。1 h后，处死大鼠，取出大脑，将缺血侧大脑组织匀浆，置于50%三氯醋酸，混匀，放置24 h，测定620 nm处OD值。同时测定已知浓度的梯度伊文思蓝溶液的OD值，并绘制标准曲线。根据标准曲线计算出待侧样品的伊文思蓝含量。

1.7 ELISA检测大脑TNF-α的含量在相应缺血时点取大鼠缺血脑组织，匀浆。将标准蛋白样品和待侧样品加入包被好一抗的96孔板，按试剂盒说明书步骤操作，最后测定450 nm波长处的OD值。根据已知浓度的标准蛋白的OD值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算各待测样品的TNF-α含量。

1.8 Western blot检测脑组织MMP-9的表达水平

在相应缺血时点，取大鼠缺血脑组织100 mg加入到1 ml蛋白裂解液，匀浆，离心提取总蛋白，并测定蛋白浓度。经灌胶、上样、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭等步骤后，加入一抗(兔抗大鼠MMP-9多克隆抗体、鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体)，4℃孵育过夜，加入相应二抗，室温孵育2 h，再经显影、定影、图像采集等，用Quantity one软件分析蛋白条带。

2 结果

2.1 姜黄素对大鼠脑缺血神经功能损伤和脑梗死体积的作用假手术组大鼠神经功能无损伤，脑缺血/再灌注损伤24 h大鼠神经功能损伤评分增高(2.1 ±0.6，P<0.01)，姜黄素 50 mg·kg－1治疗组减轻大鼠脑缺血/再灌注诱导的神经功能损伤(1.5±0.3，P<0.5)，而姜黄素 10 mg·kg－1则无明显作用(1.9±0.4，P>0.05)。

假手术组未见脑梗死，脑缺血/再灌注损伤24 h大鼠脑梗死体积明显增大(186.47±13.2 mm3，P<0.01)，姜黄素10 mg·kg－1治疗组脑梗死体积(157±10.7 mm3，P<0.05)和 50 mg·kg－1治疗组脑梗死体积(145.83±8.63 mm3，P<0.01)均小于溶媒组脑梗死体积，姜黄素50 mg·kg－1治疗组脑梗死体积小于姜黄素10 mg·kg－1治疗组(P<0.05)。

2.2 姜黄素对大鼠脑缺血中性粒细胞浸润的抑制作用大鼠脑缺血/再灌注损伤24 h，缺血脑组织MPO活性明显增高，姜黄素10 mg·kg－1和50 mg·kg－1治疗组均可减轻缺血脑组织MPO的活性，即抑制脑组织中性粒细胞的浸润，且姜黄素50 mg·kg－1治疗组对中性粒细胞的抑制作用明显大于姜黄素 10 mg·kg－1治疗组(Tab 1)。

Tab 1 Effect of curcumin on the MPO activity and evans blue(EB)content in ischemic brain following cerebral ischemia/reperfusion in rats(±s，n=8)

#P<0.05，##P<0.01 vs sham;*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle;△P<0.05，△△P<0.01 vs curcumin 10 mg·kg－1

Group MPO activity/U·g－1tissue EB content/μg·g－1tissue Sham 0.15±0.034 3.24±0.53 Vehicle 0.47±0.056## 14.52±2.46##Curcumin 10 mg·kg－1 0.38±0.083*## 13.74±2.58##Curcumin 50 mg·kg－1 0.32±0.061**#△ 8.67±1.58**#△△

2.3 姜黄素改善大鼠脑缺血后血脑屏障的完整性大鼠脑缺血/再灌注损伤24 h，缺血脑组织伊文思蓝含量明显增高，表明血脑屏障通透性增高、完整性破坏。姜黄素50 mg·kg－1治疗组明显减轻缺血脑组织伊文思蓝的含量，即姜黄素50 mg·kg－1可明显减轻脑缺血诱导的血脑屏障破坏;而姜黄素10 mg·kg－1治疗组对血脑屏障的通透性无明显作用(Tab 1)。

2.4 姜黄素减少大鼠缺血脑组织TNF-α的含量大鼠脑缺血/再灌注损伤24 h，缺血脑组织TNF-α的含量明显增高。姜黄素10 mg·kg－1和50 mg·kg－1治疗组均可减轻缺血脑组织TNF-α的含量，且姜黄素50 mg·kg－1治疗组对TNF-α的抑制作用大于姜黄素10 mg·kg治疗组(Fig 1)。

Fig 1 Effect of curcumin on the content of inflammatory factorTNF-α in rat brain after cerebral ischemia(±s，n=8)

2.5 姜黄素降低大鼠缺血脑组织MMP-9的表达水平大鼠脑缺血/再灌注损伤24 h，缺血脑组织MMP-9的蛋白表达明显增高。姜黄素50 mg·kg－1治疗组明显降低缺血脑组织MMP-9的蛋白表达水平，而姜黄素10 mg·kg－1治疗组对缺血脑组织MMP-9的蛋白表达水平无明显抑制作用(Fig 2)。

Fig 2 Effect of curcumin on the expression of MMP-9 in rat brain after cerebral ischemia(±s，n=8)

3 讨论

姜黄素是一种从姜黄属药用植物中提取的黄颜色多酚物质。实验证明，姜黄素具有多种生物学功能，包括抗肿瘤［8］、抗氧化和抗炎症［9］等作用。近年来，国内外学者发现姜黄素可以减轻缺血性脑损伤，对脑缺血起保护作用。Zhao等［4］发现姜黄素可以通过抑制Caspase的表达，减轻神经元凋亡。周瑞等［5］利用大鼠全脑短暂性缺血模型，证实姜黄素可以通过降低N-甲基-D-天门冬氨酸受体亚单位(NR2A)的表达和增加NR2B的表达，进一步抑制海马区神经元凋亡，从而起神经保护作用。

我们的实验通过建立大鼠脑缺血/再灌注模型，首先证实了姜黄素具有减轻脑缺血神经功能损伤和脑梗死体积的作用，即姜黄素对大鼠脑缺血具有神经保护作用，且姜黄素50 mg·kg－1剂量组的保护作用更为明显。随后为了进一步研究姜黄素脑保护作用的机制，我们检测了MPO在缺血脑组织中的活性，结果显示脑缺血后MPO活性明显升高，而姜黄素 10 mg·kg－1组和 50 mg·kg－1组均可减轻 MPO的活性。因为MPO反映中性粒细胞浸润脑组织的程度，同时也反映脑组织炎症反应的程度［10］，所以姜黄素可明显减轻脑缺血的炎症反应。因此，我们也可以推测姜黄素通过减轻炎症反应，进一步减轻缺血性脑损伤。TNF-α是一种诱导炎症反应重要的细胞因子，本实验结果还证实了姜黄素10 mg·kg－1组和 50 mg·kg－1组均可减少脑组织 TNF-α 的含量，这充分说明了姜黄素对炎症反应的抑制作用，也进一步证明了姜黄素通过减轻炎症因子和炎症反应而减轻缺血性脑损伤。

血脑屏障的破坏是缺血性脑损伤的重要病理生理机制之一。脑缺血后炎症反应和炎症因子的释放可以增加血脑屏障通透性，而血脑屏障通透性的增加又可以进一步增加血液中白细胞在缺血脑组织中的浸润，从而加重炎症反应［11，12］。MMP-9 是一种可以降解血脑屏障基底膜的酶类物质，其表达量和活性的增高可促进血脑屏障通透性的增高［3，11］。我们的实验发现姜黄素50 mg·kg－1组可以明显减轻脑缺血诱导的血脑屏障破坏，此外姜黄素50 mg·kg－1组还可以降低缺血脑组织MMP-9的蛋白表达量，而姜黄素10 mg·kg－1组不能减轻血脑屏障破坏和MMP-9的表达。因此，我们推测姜黄素是通过降低MMP-9的表达改善血脑屏障的完整性，从而减轻缺血性脑损伤。

综上所述，姜黄素可以减轻大鼠缺血性脑损伤。姜黄素抑制TNF-α的释放和炎症反应、减轻MMP-9的表达和改善血脑屏障的完整性可能是姜黄素减轻缺血性脑损伤的机制之一。姜黄素作为一种无毒、价格低廉的物质，有望成为新型的抗缺血性脑中风的治疗药物。

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