胃泌素对人结肠癌细胞NF-κB信号通路的影响

曹 俊，邹晓平，于成功，于红刚

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院消化内科，江苏南京 210008;武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉 430060)

胃泌素是一种多肽类激素和营养因子，能促进上消化道黏膜生长。近年来，研究发现［1，2］胃泌素也具有促进大肠癌生长的作用，而且已在不同的细胞模型中证实了胃泌素的促增殖作用是通过与其受体(CCK-2R)结合进行调控的，并发现可增加肿瘤的侵袭和转移。核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)异常活化研究表明与某些系统肿瘤的浸润转移密切相关。NF-κB可激活与浸润转移相关的某些重要因子的表达，进而发挥其在肿瘤进展中的重要作用［3］。尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一种丝氨酸蛋白酶，与其受体结合后激活纤溶酶原，转化成纤溶酶，进而激活金属蛋白酶等多种蛋白酶，参与肿瘤的侵袭、转移等过程［4］。前期研究［5］发现 NF-κB 在大肠癌组织中持续活化，本研究进一步研究胃泌素对大肠癌细胞NF-κB的活化及uPA表达的影响，了解胃泌素对人结肠癌的生物学效应和信号转导。

1 材料与方法

1.1 实验材料 结肠腺癌细胞株Colo320细胞购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。人胃泌素受体(gastrin receptor，GR)真核表达载体 pCR3.1/GR、真核表达空载体pCR3.1和胃泌素受体拮抗剂L365，260由德国波鸿大学St-Josef医院分子消化研究室馈赠。胃泌素(Gastrin-17，G17，美国Sigma公司)，兔抗人多克隆抗 uPA和 ECL试剂盒(美国Santa Cluz公司)，兔抗人多克隆抗NF-κB p65(美国Cell Signaling Technology公司)，二硫氨基甲酸吡啶(PDTC，美国Sigma公司)，核蛋白提取试剂盒(美国 Active Motif公司)，Gel Shift Assay Systems试剂盒(美国Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人结肠肿瘤细胞系Colo320细胞用10%FBS的RPMI 1640完全培养基置于培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染与筛选 见参考文献［6］。简言之，脂质体稳定转染pCR3.1/GR到Colo320细胞，用浓度500 mg·L－1G418筛选。筛选出的G418抗性克隆后，通过RT-PCR和免疫印迹鉴定CCK-2R(胃泌素受体)的表达，将阳性克隆命名为 Colo320WT。

1.2.3 实验分组 分为对照组(C)、胃泌素组(G17)、胃泌素 +L365，260 组(G17+L365，260)及L365，260 组。胃泌素组用 10－8mol·L－1胃泌素干预Colo320WT细胞12 h，胃泌素加 L365，260组是应用 10－6mol·L－1胃泌素受体拮抗剂 L365，260 预干预 Colo320WT 细胞30 min，再加10－8mol·L－1胃泌素干预 12 h，L365，260 组是 10－8mol·L－1胃泌素受体拮抗剂 L365，260干预Colo320WT细胞30 min。

1.2.4 EMSA(电泳迁移率检测) 按试剂盒说明书进行，简言之，抽提细胞核蛋白，γ-32P标记NF-κB寡核苷酸探针 (5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′)。DNA-核蛋白结合反应物进行非变性聚丙烯酸凝胶电泳，将凝胶置于Whatman3MM滤纸上，干胶，X线片放射自显影。

1.2.5 免疫印迹 Bradford方法测定蛋白浓度。在分离胶/积层胶上进行十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。脱脂奶粉室温封闭2 h，分别用抗uPA抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜，二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，ECL显影。

1.2.6 逆转录-PCR 按照TRIzol试剂盒一步法提取总的RNA，按逆转录试剂盒说明逆转录合成第一条链cDNA，从每个样品中取1μl用于PCR，扩增反应条件如下:95℃ 5 min，95℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72℃1 min为一个循环，共25个循环;0.7%琼脂糖凝胶电泳。引物及扩增产物大小如下:uPA引物:上游引物为 5′-GGGGAGCAGAGACACTAACGAC-3′，下游引物为 5′-AAGGAAGGGATAACTGGCCAAG-3′，产物片段大小为 350 bp;β-actin引物:上游引物为 5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′，下游引物为5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，产物大小为479 bp，均由上海生物工程公司合成。

1.2.7 激酶阻断实验 Colo320WT细胞先用100 mg·L－1的NK-κB特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶(PDTC)预处理30 min，然后再添加 10－8mol·L－1胃泌素干预12 h，提取细胞蛋白并通过免疫印迹测定uPA的表达。

2 结果

2.1 胃泌素对NF-κB p65活化的影响 胃泌素干预Colo320WT细胞后，抽提细胞核提取物并用EMSA测定NF-κB p65的活性，发现胃泌素干预后其活性较未干预前明显增加，当用胃泌素拮抗剂L365，260阻断后，活性又降低，见Fig 1。

Fig 1 Effect of gastrin-17 on NF-κB p65 activation in Colo320WT cellsC:Control;G17:gastrin17;L:L365，260

2.2 胃泌素对uPA蛋白表达的影响 胃泌素干预Colo320WT细胞后，发现uPA蛋白表达较未干预前上调。当用胃泌素拮抗剂L365，260阻断后，表达则下降，见Fig 2。

Fig 2 Effect of gastrin-17 on expression of uPA protein in Colo320WT cells

2.3 胃泌素对uPA的mRNA表达的影响 胃泌素干预Colo320WT细胞后，通过RT-PCR检查uPA的mRNA表达，结果发现uPA的mRNA明显较未干预前增加，但当用L365，260阻断后表达又明显下降，见 Fig 3。

Fig 3 Effect of gastrin-17 on expression of uPA mRNA in Colo320WT cells

2.4 PDTC对uPA蛋白表达的影响 为了研究胃泌素是通过NF-κB而引起uPA表达增加，我们用NF-κB特异性阻滞剂PDTC预处理细胞，然后再用胃泌素干预，结果发现PDTC预处理后uPA的表达并没有明显上调，这说明了uPA的表达上调是通过NF-κB活化而引起的，见 Fig 4。

Fig 4 Effect of PDTC on expression of uPA

protein in Colo320WT cells by gastrin-17 stimulation

3 讨论

胃泌素是一种多肽类激素和营养因子，近年来研究发现胃泌素不仅可以促进大肠癌的发展，而且可通过活化粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)通路促进大肠癌的侵袭和转移［2，7］。NF-κB 在正常情况下存在于胞质与其抑制物IκBα结合。当细胞受到细菌或病毒感染、炎症细胞因子等刺激时，IκBα将发生磷酸化并迅速降解，NF-κB就被释放、激活并转入细胞核内调控一系列的基因表达。研究表明NF-κB对于基质金属蛋白酶9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)等与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移有调节作用。uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，参与肿瘤的的侵袭和转移等过程。另研究表明作为NF-κB通路的下游分子uPA的启动子区域包含有NF-κB结合位点，活化的NF-κB进入细胞核与uPA启动子区域结合而上调其表达［8］。

我们前期研究发现，胃泌素干预Colo320WT细胞12 h后，对结肠癌细胞的侵袭和转移达到最大效应，故本研究我们依然采用这个时间点来研究胃泌素对NF-κB通路的影响［2］。Colo320结肠癌细胞是低表达胃泌素受体CCK-2R，我们稳定转染了CCK-2R于Colo320细胞后构建高表达胃泌素受体的Colo320WT细胞。研究中用 10－8mol·L－1胃泌素干预结肠癌细胞Colo320WT后，应用EMSA检查NF-κB活性，结果发现NF-κB活性较未干预时增加，但当用 10－6mol·L－1胃泌素拮抗剂 L365，260 预干预Colo320WT后，发现L365，260可阻断胃泌素的效应，NF-κB活性没有明显增加，这充分说明了胃泌素可活化NF-κB。由于 uPA是NF-κB通路的下游分子，我们检查了uPA的mRNA和蛋白的表达，发现胃泌素可明显上调uPA的表达。另一方面我们通过激酶阻断实验(即应用 NF-κB特异性拮抗剂PDTC)，发现了添加PDTC后，胃泌素并不能使 uPA的表达增加，这也说明了胃泌素上调uPA的表达是通过其活化NF-κB，继而引起uPA转录和翻译水平的增加。

总之，本研究证明了胃泌素与其受体CCK-2R结合后，活化了结肠癌细胞Colo320WT中NF-κB通路，上调uPA的表达，参与结肠癌的发生发展，为我们进一步提供了防治肿瘤的新思路。

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