PCR和染色镜检方法诊断猪附红细胞体的比较

贾杏林 (湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128;中国农业大学动物医学院，北京 100094)

齐长明 (中国农业大学动物医学院，北京 100094)

沈志强， 田凤荣，庄金秋 (山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256618)

PCR和染色镜检方法诊断猪附红细胞体的比较

贾杏林
(湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128;中国农业大学动物医学院，北京 100094)

齐长明
(中国农业大学动物医学院，北京 100094)

沈志强， 田凤荣，庄金秋
(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256618)

参照Hoelzle等报道的猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)PCR诊断方法，提取病原DNA进行PCR扩增，经克隆、测序得到781 bp片段，与Genbank中序列(登录号AJ504999)进行比较，同源性为99.4%。用该方法从大肠杆菌等猪常见病原基因组未扩增出相同的序列，表明其特异性好。以PCR和染色镜检方法分别检测3个猪场15份临床发病猪血液样品，M.suis阳性率均为100%，结果符合率为100%，差异不显著(Pgt;0.05)；PCR检测和涂片染色镜检5个猪场25份临床健康猪血样，M.suis阳性率分别为100%和68.0%，二者符合率为68.0%，差异显著(Plt;0.05)。

猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)；PCR；染色镜检

猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)病是一种以贫血、黄疸和发热为主要特征的人畜共患病,我国多个省市都有该病发生，给养猪业带来了较大的经济损失[1]。在该病的病原学诊断方法中，确诊猪群慢性感染标准是脾切除和显微镜观察来证实猪的寄生虫血症，通过临床症状来证实急性发病[2],但此法不适合群体诊断。血液涂片染色镜检方法是目前诊断该病原最常用的方法，该方法快速简便，但有学者认为猪红细胞形态变化可以由许多因素导致[3],因此形态学诊断结果的可靠性需要进一步研究。Hoelzle等报道了PCR诊断方法,该方法准确可靠、灵敏度高，适合大量样品的检测[4]。本研究对M.suis涂片染色镜检方法和PCR方法进行了比较，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)实验猪血 15份患病猪血采自山东省表现出猪附红细胞体病临床症状的3个猪场，病猪皮肤发红，体温40.0～41.5 ℃,采食减少、饮水增加；25份临床健康猪血采自山东省5个猪场，猪临床指标正常。所有血液样品用肝素钠抗凝，血液涂片后姬姆萨染色见红细胞周围有微生物附着，呈小突起状，SPF猪血由中国农业大学司兴奎博士馈赠。

(2)对照细菌和病毒 链球菌购自中国兽药监察所，巴氏杆菌、大肠杆菌O78、沙门氏菌由山东滨州兽医生物技术重点开放实验室分离鉴定；羊边虫、巴贝斯焦虫基因组由中国农科院兰州兽医研究所馈赠；猪弓形体抗原购自中国农科院兰州兽医研究所；PRRSV由中国农业大学实验动物所馈赠；PRV为疫苗毒株。

(3)酶及主要试剂 pUC18-T、蛋白酶K、IPTG、X-gal、DNA胶回收试剂盒、反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶购自上海生物工程公司。CTAB购自鼎国生物技术中心。

(4)引物的设计与合成 引物参照Hoelzle 等[4]的方法由上海生工合成，上游引物(P1)为5’-GCATTGCCCAGTCCCCAAGGA-3’，下游引物(P2)为5’-TGCGGGGAGTACGTGGGAAGG-3’。

1.2 试验方法

(1)病原DNA的提取M.suis基因组的提取参照Hoelzle等[4]的方法略作改动。取500 μL猪血加入1.5 mLEP管中，13 000 r/min离心20 min，弃去上清；沉淀中加入400 μLTE(pH 8.0)溶解，然后加入15 μL溶菌酶混匀后37 ℃水浴1 h，再加入10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和70μL10%SDS溶液56 ℃水浴30min；加入 100 μL5 mol/L NaCl溶液和160 μL5%CTAB溶液，65 ℃水浴10 min；加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提2次，等体积冷异丙醇沉淀30 min，12 000 r/min离心10 min；70%乙醇溶液漂洗1次，干燥，TE(pH8.0)溶解，-20 ℃保存。弓形体、链球菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌和巴氏杆菌培养离心后，基因组的提取同上述方法。PRV和PRRSV基因组提取按文献[5,6]的方法进行。

(2)PCR扩增 50 μL体系中加入5 μL 10×Buffer溶液，31.5 μLddH2O，4 μL25 mmol/L MgCl2溶液，3 μLdNTP，上、下游引物各2 μL，2 μLM.suis基因组，0.5 μLtaq DNA聚合酶，混匀，放入PCR仪中扩增。反应条件为：94 ℃预热10 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共36个循环，最后72 ℃延伸7 min。对照病毒、细菌用同样的条件进行PCR扩增。

(3)PCR产物的克隆与测序 将PCR产物加样于1%琼脂糖凝胶上电泳，2 000 bp Marker作对照，用回收试剂盒回收约大于780 bp的片段，回收产物连接到PUC18-T载体上，转化到DH5α感受态细胞，阳性菌液送上海生工测序。将所测得核苷酸序列片段与Hoelzle等[4]报道的诊断序列进行同源性比较。

(4)PCR与涂片染色方法比对试验 用PCR与涂片染色镜检方法同步检测8个猪场40份送检猪血，分别统计阳性阴性结果，并进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 涂片染色结果

检测40份血液样品M.suis均为阳性，红细胞表面有点状突起，形状不规则，有染成紫色的M.suis附着(图版Ⅱ图1)。

2.2 M.suis诊断序列的扩增

经PCR扩增得到大约780 bp的DNA片段，与预期片段大小一致。阴性对照未扩增出片段(图版Ⅱ图2)。

2.3 测序分析及同源性比较

目的片段与PUC18-T载体连接并转化到DH5α感受态细胞后，阳性细菌送往上海生工测序，大小为781 bp，与Genbank上的M.suis相关序列(登录号AJ504999)比较，同源性为99.4%，该诊断序列DNA在53 bp处A变成了G；在161 bp、246 bp、247 bp处各缺少一个C；780 bp和781 bp之间多出一个C，表明该PCR方法扩增的是M.suis特异性的条带。

2.4 M.suis诊断序列扩增的特异性

用该引物和反应条件未从SPF猪血和猪弓形体、羊鞭虫、链球菌、巴贝氏焦虫、大肠杆菌、PRRSV、PRV、沙门氏杆菌、巴氏杆菌中未扩增出该片段(图版Ⅱ图3)，表明该方法有较好的特异性。

2.5 比对试验

用涂片染色镜检方法与PCR同步检测8个猪场送检40份猪血，2种方法检测结果总符合率为80.0%(32/40)，差异显著(Plt;0.05)；其中3个发病猪场15份血液样品，M.suis阳性率均为100%，二者符合率为100%，差异不显著(Pgt;0.05)；检测5个临床健康猪场25份血液样品，涂片染色方法M.suis阳性率为100%，PCR检测M.suis阳性率为68.0%，二者符合率为68.0%，差异显著(Plt;0.05)。

3 讨论

血液涂片染色镜检是检测M.suis的最快速简便直观的方法，但其不足之处是容易出现假阳性。Hoelzle等建立了诊断M.suis的PCR方法，通过斑点杂交证实了该方法的特异性[4]。本研究对该方法进行了改进，扩增到同源性高达99.4%的片段，用该方法未从其他常见猪病病原中扩增到DNA片段，表明该方法有较好的特异性。

国外文献少见猪附红细胞体病暴发和猪严重死亡的报道，且多以贫血、黄疸等慢性疾病为主，而国内多以大面积暴发、高热红皮、死亡率高为主，出现这种情况可能是由于病原变异所致，但目前关于该病的分子流行病学研究报道较少，因而急需进行该方面的研究，为更好的防制该病提供基础。

本研究采用2种方法分别检测同一血样，对临床发病猪二者符合率高达100%，但对M.suis病原携带临床健康猪符合率大大降低。究其原因，一方面是由于染色镜检可能存在假阳性等局限，另一方面与发病猪本身携带病原，其单位体积血样病原数可能更多有关。因此，在对猪附红细胞体病的疑似病例进行确诊时结合PCR诊断是很必要的。

[1]Wu J,Yu J,Song C,etal.Porcine eperythrozoonosis in China[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1081:280～285.

[2]Heinritzi K.A contribution on splenectomy in swine[J].Tierarztl Prax,1984,12:451～454.

[3]张家峥，刘小燕，李召展，等．对猪发生“附红细胞体病”的调查研究和讨论[J].河南畜牧兽医,2003,24(1):26～29.

[4]Hoelzle LE,Adelt D,Hoelzle K,etal.Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection ofMycoplasmasuis(Eperythrozoon suis) in porcine blood[J].Vet Microbiol.,2003,93:185～196.

[5]李学伍，陈焕春，杨艳艳，等．PCR法对伪狂犬病病猪不同部位的检测及敏感性试验[J]．中国畜禽传染病，1998,20(6):365～368.

[6]仇华吉，郭宝清，童光志，等．猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-La株基因型鉴定[J].中国兽医学报，1998,18(2):118～120.

2010-08-05

湖南省科技厅资助项目(2009FJ3021)；湖南省教育厅资助项目(10C0809)

贾杏林(1970-)，男，湖北天门人，农学博士，副教授，主要从事动物输血与血液病研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.012

S852.62

A

1673-1409(2010)03-S032-03