补肾固黄汤改善胚泡着床障碍小鼠子宫内膜组织形态的实验研究

王文娟 余 峥 江胜芳 张昌军 彭海英

1 郧阳医学院附属人民医院（十堰 442000）

2 湖北中医学院硕士生（武汉 430061）

胚胎种植关键在于具备有着床能力的胚胎和具有接受胚胎能力的子宫内膜。随着辅助生殖技术的发展，胚胎质量得到了明显的提高，但胚胎种植率和临床妊娠率并无显著上升，这说明子宫内膜对胚胎的接受能力即子宫内膜容受性，为胚胎种植的重要约束因素。如何提高子宫内膜容受性是目前研究的热点。本实验探寻中药补肾固黄汤对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜容受性的影响及其机制，拟从中医角度探索改善子宫内膜容受性的新方法。现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）实验动物：清洁级昆明小鼠，由郧阳医学院实验动物中心提供，8～10周，体质量25～35g，自由饮水饮食，室温22～25℃，每天光照10h，黑暗14h。（2）药物与试剂：补肾固黄汤（熟地黄、当归、丹参等组成），所用中药购自十堰市人民医院中药房，制成含生药量1.2g/mL的煎剂，超净台内分装入无菌容器内，并进行高压消毒、封存，－20℃保存；米非司酮片由湖北葛店人福药业有限公司生产，研钵研碎，溶于丙二醇（国产分析纯）中，配置成0.8g/mL悬浊液，4℃保存。

1.2 方法 （1）分组及给药：将雌鼠随机分成3组：正常组、中药组、模型组，观察其动情周期，中药组每1个动情周期后期行补肾固黄汤0.3mL灌胃1次，其余两组灌服相同体积生理盐水，持续2个动情周期，并将动情期差异大的小鼠剔除。第3个动情周期，按雌雄2∶1～3∶1合笼，次晨发现阴栓者记为妊娠第1天（D1）。从D1开始，每天上午9：00中药组灌服补肾固黄汤0.3mL，正常组、模型组灌服相同体积生理盐水。（2）动物造模及标本收集：参考文献[1]的造模方法，D4上午7：00中药组、模型组皮下注射米非司酮溶液0.1mL。于D5晚上7∶00处死小鼠，收集标本。处死小鼠前10min尾静脉注射0.5%台盼蓝溶液0.125mL，颈椎脱臼处死小鼠，取出子宫，放入生理盐水中去除子宫周围系膜、脂肪，取一侧子宫投入4%多聚甲醛固定12h后，石蜡包埋切片，常规HE染色。

2 结果

2.1 各组小鼠子宫大体形态观察 见图1。正常组小鼠较模型组小鼠子宫增粗增长，系膜充血，肉眼可见多个蓝染点，左右对称；中药组小鼠较模型组小鼠子宫增粗，蓝染点数目增多，且可见染色处膨隆，但与正常组比较数量较少；模型组小鼠子宫细长，除染色点处膨隆外，其余部分均未改变，蓝染点明显较前两组少，且左右不对称。

图1 各组小鼠子宫大体观

2.2 各组小鼠子宫内膜组织学形态学表现 见图2。光镜下观察子宫组织HE染色：正常组子宫腺体数量多，腺体弯曲，腺腔扩张，腺腔及宫腔中可见较多分泌物，腺体分布均匀，散布于间质中，腺上皮呈单层柱状排列，核圆形，位于细胞基底部，间质疏松、水肿，子宫腔上皮较厚；中药组腺体与间质发育同步，腺体数量多、腺腔弯曲，间质疏松、水肿，与正常组表现相似；模型组子宫腺体数量少，腺体小而直，分布不均匀，聚集于一处，有的间质较致密，细胞体积变小，有的较疏松，表现为腺体、间质发育不同步，子宫腔上皮、腺上皮细胞变矮、排列紊乱。

图2 各组小鼠子宫内膜HE染色图片

3 讨论

子宫内膜容受性是指内膜处于一种允许胚胎黏附、穿透并植入而导致胚胎着床的状态，是子宫内膜接受胚胎着床的一种综合状态[2]。正常子宫内膜仅在一个极短的关键时期内允许胚泡着床，这一时期约为正常月经第20～24天，在这一时期子宫内膜受激素、细胞因子、黏附分子及糖蛋白等多种因素的调节，发生一系列变化，表现出最大的胚泡种植容受性，被称为“植入窗”期（简称窗口期）。

子宫内膜容受性下降可以表现为窗口期子宫内膜组织形态学的改变。在尿LH峰日超声检测子宫内膜形态：A型妊娠率明显高于C型，子宫内膜呈现C型改变是胚胎着床障碍的一个重要表现。李权等[3]比较A、C两型窗口期子宫内膜组织学形态，发现C型子宫内膜的腺腔轻度增大，见核下空泡，A型子宫内膜的腺腔增大明显，腺腔内分泌旺盛，表明C型子宫内膜腺体发育迟缓，而A型则正常。陈秋梅等[4]发现高达81.5%的排卵障碍不孕者子宫内膜组织形态学表现异常。

米非司酮是一种孕激素受体拮抗剂，能竞争性地与孕激素受体结合，阻断孕激素在靶器官发挥生理效应。围着床期使用低剂量米非司酮拮抗孕激素的作用，可阻断上皮孕激素受体的下调，及基质旁分泌因子的合成，从而抑制上皮的分泌和基质的蜕膜化，达到阻止胚胎着床的目的。研究显示，米非司酮可以引起孕鼠胚泡着床率与着床胚胎数下降，使孕鼠子宫内膜发育滞后，主要表现为内膜腺体与间质发育不同步[5]。本实验也证实，米非司酮引起的模型组小鼠子宫内膜腺体数量少，腺体小而直，分布不均匀，聚集于一处，有的间质较致密，细胞体积变小，有的较疏松，表现为腺体、间质发育不同步，子宫腔上皮、腺上皮细胞变矮、排列紊乱。

中医学认为，“肾主生殖”、“经水出诸肾”，肾虚是不孕症主要病因病机，肾虚则胎元不固，出现胚胎着床障碍。我国著名中医妇科专家黄绳武老先生认为不孕症重点在肾，旁及肝、脾。实验研究显示补肾中药可以改善子宫内膜组织学形态，增加子宫内膜血流，提高子宫内膜容受性相关标志物水平，从而改善子宫内膜容受性。陈秋梅等[4]收集子宫内膜组织形态学表现异常的排卵障碍不孕者，给予以补肾为主的调经孕育方药，药后内膜形态学有明显改善，增殖期和分泌期内膜功能明显活跃旺盛，接近或完全符合正常生理状态下的表现。故本研究以补肾为核心，根据黄体期阳气升发之理，以清代名医傅青主之补肾助孕良方养精种玉汤（熟地黄、当归、白芍、山茱萸肉）为基本方，加巴戟天、仙灵脾、续断以温补肾阳，佐以女贞子、阿胶、丹参等补血活血，以改善子宫血液循环，增加子宫内膜容受性。本实验证实，经过中药治疗后，胚泡着床障碍小鼠较模型组子宫内膜腺体数目增多，腺腔扩张、弯曲，腺腔、宫腔均有较多分泌物，与正常组表现相似，表明补肾固黄汤可以改善胚泡着床障碍小鼠子宫内膜组织学形态。

本实验发现米非司酮抗早孕的可能机制是促使子宫内膜发育不良，而中药补肾固黄汤可以改善米非司酮药后子宫内膜组织学形态，使其与正常保持一致，从而提高子宫内膜容受性。米非司酮作为一种孕激素受体拮抗剂，其引起的胚泡着床障碍可以被补肾固黄汤对抗；孕激素可以促进子宫内膜呈分泌期改变，使子宫内膜组织学形态符合窗口期特征，适合胚胎着床。补肾固黄汤是否在孕激素分泌及其受体表达方面有特殊作用是本实验下阶段的研究重点。

[1]刘艳娟,黄光英,龚萍,等.对两种胚泡着床障碍小鼠模型围着床期子宫内膜形态结构的比较研究[J].中国药理学通报,2006,22(9）：1067 ～ 1070.

[2]高敏芝,李文英,刘桂梅,等.彩色多普勒超声监测子宫内膜和内膜下血流对IVF患者子宫容受性的预测价值 [J].生殖与避孕,2007,27(6）：399 ～403.

[3]李权,谭晓珊,陈家仙,等.A、C型子宫内膜种植窗期形态学特征[J].中国妇幼保健,2009,24(1）：84～86.

[4]陈秋梅,张树成,贺彬,等.调经孕育方药对排卵障碍性不孕者子宫内膜感受态的影响——组织形态学分析 [J].中医药学刊,2004,32(3）：464 ～467.

[5]刘艳娟,黄光英,杨明炜,等.对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜容受性的研究[J].生殖与避孕,2008,28(3）：144～149.