铜绿假单胞菌对β-内酰胺类药物耐药相关基因的研究

乔立冬 邢台市人民医院检验二科（054001）

铜绿假单胞菌对β-内酰胺类药物耐药相关基因的研究

乔立冬 邢台市人民医院检验二科（054001）

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌β-内酰胺类药物耐药相关基因的存在状况，以便为临床选择用药提供依据。方法自临床分离的 95株铜绿假单胞菌，采用聚合酶链反应（PCR）检测耐药基因（TEM、SHV、OXA、PER、GES、IMP、VIM、DHA和 OprD2）结果95株铜绿假单胞菌中，发现了7种耐药基因，其中25%菌株检测到两种耐药基因。结论铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素的多重耐药是由多种耐药基因决定的。提示该菌具有复杂的耐药机制。

铜绿假单胞菌；耐药基因；β-内酰胺类抗生素

近年来，随着抗生素的不断开发和广泛应用，感染菌的菌群分布亦随之发生变迁。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa），是医院内感染最常见的致病菌之一，引起的医院内感染在国内约17.27%[1]，居第二位，国外报道10～31.5%[2]，居病原菌之首。近年来，P. aeruginosa耐药性不断增加，已经出现对3代头孢菌素和亚胺培南耐药的P. aeruginos菌，给临床治疗带来极大困难。研究发现，P. aeruginos产生的各种β-内酰胺酶（如 TEM、SHV、OXA、PER、VER、GES、CARB）、金属β-内酰胺（如IMP、VIM）和质粒头孢菌素酶（如DHA）以及外膜孔蛋白D2（OprD2）缺失，是对β-内酰胺类药物耐药的主要机制[3-8]。为了解我院临床分离的 P. aeruginosa对β-内酰胺类药物耐药原因，该文采用分子生物学技术检测了9种β-内酰胺类药物耐药相关基因（TEM、SHV、OXA、PER、GES、IMP、VIM、DHA和OprD2）报告如下：

1 材料和方法

液。置入-20℃冰箱备用。

1.4 基因检测，均为PCR法各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。

各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各 0.5µmol/L、kcl 10mmol/L(NH4)2SO48mmol/L、Mgcl 2mmol/L、Tris-Hcl (PH9.0)10mmol/L、NP400.5%、BAS 0.02%、TaqDNA pol 1µ。总反应体积20µl（其中模板液5µl）。循环参数为：93℃，预变性2min，然后93℃ 6 0s→55℃，60s→72℃60s，循环 35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

Table 1 Primers of Target Genes and PCR Products

2 结果

2.1药物敏感性试验，见表2。可见菌株对β-内酰胺类药物耐药性均非常严重。

Table 2 Sensitivity of 95P.aeruginosas to 17 Antibiotics

2.2 基因PCR检测95株P. aeruginosa中，TEM、VIM、IMP、OXA、PER、GES，DHA阳性率分别为：51.6%、40.1%、38.9%、32.4%、30.8%、30.3%、4.0%，而SHV、OprD2基因均阴性。

3 讨论

1992年法国巴黎发现的TEM-42是在P. aeruginosa菌中第一个被报道的A类ESBLs[11].P. aeruginosa对多种抗生素产生耐药性，提示该菌具有复杂的耐药机制。P.aeruginosa的主要耐药机理是产生β-内酰胺酶，尤其是超广谱β-内酰胺酶，以及菌细胞外膜的通透性降低和菌体蛋白结构与功能的变化。P. aeruginosa外膜脂多糖与磷脂之间，鲍林蛋白形成的孔道比一般革兰阴性菌的孔道小，使多种抗革兰氏阴性杆菌抗生素难以通过，是该菌对不同类别抗生素呈现出固有耐药性的重要原因，这种固有耐药性使P. aeruginosa成为临床上难治致病菌之一，而主动外排系统的发现更揭示了它是P. aeruginosa固有耐药性或获得性多重耐药的更一重要原因[12]。P. aeruginosa的耐药是由于产生灭活药物的酶和（或）细菌外膜对药物的通透性降低使抗菌药物失效。由于β-内酰胺类抗生素的广泛使用和碳青霉烯酶的产生，使其耐药性明显上升，因此在临床上对抗生素使用进行宏观管理与控制成为目前减少细菌耐药性产生的主要措施之一[13]。通过分析细菌的耐药谱及耐药模式，了解感染的发生发展趋势，从而有计划地交替使用敏感性强的抗生素，是提高临床治疗效率的必然选择。

[1] 刘振声,金大鹏,陈增辉.医院感染管理学.第一版.北京军事医学科学出版社,2000:363.

[2] 陈军.铜绿假单胞菌耐药机制的研究进展.国外医学微生物学分册,2001,24(4):31.

[3] 糜祖煌.铜绿假单胞菌耐药基因及其检测[J].现代实用医学,2004,16(9):558-559.

[4] POIREL L, WELDHAGEN G F, DECHAMPS C, et al. A nosocomial outbreak of Pseudomonas aeruginosa isolates expressing the extended spetrum beta-lactamase GES-2 in South Africa [J]. Antimicrob Chemther，2002,49(3):561-565.

[5] SANSCHAGRIN F，BEJAOUI N，LEVESQUER C. Structure of CARB-4 and AER-1carbenicillin-hydrolyzing beta-lactamases[J]. Antimicrob Agents Chemother ,1998,42(8):1966-1972.

[6] DECER D，ARLET G, BERGOGNE-Berezin E, et al. Identification of a carbenicillin-hydrolyzing beta-lactamase in Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans. [J]. Antimicrob Agents Chemother，1995,39(3):771-774.

[7] SHIBATA N, DOL Y, YAMANE K, et al. PCR Typing of genetic determinants for metallo-β- lactamases and integrases carried by Gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron[J]. J Clin Microbiol, 2003,41(2):5407-5413.

[8] CASTANHEIRA M, TOLEMANM A, JONESR P, et al. Molecular characterization of aβ- lactamases gene, blagim-1, encoding a new subclass of metallo-β- lactamases[J]. Antimicrob Agents Chemother ,2004,48(12):4564-4661.

[9] 李仲兴,郑家齐.诊断细菌学.黄河文化出版社,1992:386-390.

[10] 郭永建,戴以聪,周惠平.新生儿铜绿假单胞菌随机扩增多态性 DNA 分子流行病学研究.中华医院感染学杂志,1997,7(2):69-71.

[11] MUGNIER P, DUBROUS P, CASM I, et al. A TEM derived extended spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa [J]. Antimicrob Agents Chemother ,1996,40(11):2488-2493.

[12] Nikaide H.Outer membrane barrier, as a mechanism of antimicrobial resistance.Antimicrob,Agents Chemother,1999,33(11):1831.

[13] 钱小毛,赵仲农,王亚玲.绍兴地区铜绿假单胞菌亚胺培南耐药机制研究[J].中华医院感染学杂志,2005,15(7):815-817.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.24.165

1672-2779（2010）-24-0200-02

2010-09-30）