复方益肾胶囊对大鼠糖尿病肾病的药效学研究*

宫凌涛 ，李桂霞 ，曹永刚 ，陈淑欣 ，王亚贤

(哈尔滨医科大学大庆校区药理教研室，大庆 163319；2.哈尔滨医科大学大庆校区中药教研室，大庆 163319）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的主要并发症和致死原因之一，占DM慢性并发症住院患者的33.6%[1]，基本病变为肾小球基底膜（GBM）增厚和系膜基质增生。其特征性病变是结节性肾小球硬化，也可表现为弥漫性肾小球硬化症及肾小球渗出性损害[2]。DN的发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明。DN一旦形成治疗是困难的，预防是重点,中医药对糖尿病肾病的治疗有独特的优势和治疗特色。因此笔者采用中医辨证理论，配以中药土鳖虫为主药组成的复方益肾胶囊。通过对大鼠肾小球基底膜的组织学观察和肾功能检查，发现该药对治疗糖尿病肾病有确切疗效。

1 材料和方法

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠70只，清洁级，体质量180～220 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。适应性饲养7 d，尿检阴性，健康状况良好。

1.2 实验器材 大鼠血压测定仪（日本，KN-210）；血糖测定仪（日本京都1810）；Leica RM 2135病理切片机、Leica EG1160病理包埋机、Leica DM 4000B-DFC 300 FX数据成像系统（德国Leica公司产品）。

1.3 实验试剂及药物 链尿佐菌素（STZ，Sigma公司提供）。马来酸依那普利，石家庄药业集团欧意药业有限公司，批号：国药准字H20055813，生产批号：0808201，规格：5 mg/片。复方益肾胶囊由哈尔滨医科大学大庆校区中药制剂室提供。

1.4 药物配制土鳖虫水提物 土鳖虫水浸12 h，匀浆后于65℃恒温水浴4 h，过滤定容成2 kg/L。土鳖虫脂取物：土鳖虫正丁醇萃取液浓缩成2 kg/L。复方益肾胶囊：附桂地黄丸组成加枸杞、益母草制成颗粒后与土鳖虫实验优化结果结合装入胶囊备用，0.40 mL/胶囊（含生药 0.70 g）。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立[3-4]选择Wistar雄性大鼠70只,180～220 g。随机选10只设为空白对照组，普通喂养。余60只喂以高脂饲料（基础饲料加蔗糖、炼猪油、胆固醇等混合而成，比例为 6∶5∶25∶1），1 周后将STZ1.5 g溶于0.1 mol/L配制的柠檬酸三钠—柠檬酸缓冲液（pH值为 4.5）300 mL中,含柠檬酸三钠882 mg，含柠檬酸630 mg，给大鼠STZ25 mg/kg腹腔注射,连续4周,继续喂以高脂饲料，同时给予青霉素预防感染。4周后尾静脉采血测定空腹血糖（禁食8h）及糖耐量实验（OGTT）2 h后血糖（根据OGTT成人75 g/次的国际标准以大鼠体表系数换算），空腹血糖≥13.8 mmol/L或OGTT2 h后血糖≥16.7 mmol/L大鼠造模成功，造模时间共5周。

2.2 分组 挑选造模成功50只糖尿病肾病大鼠，随机分成糖尿病模型组、土鳖虫水提物组、土鳖虫脂取物、复方益肾胶囊组、阳性药物对照组（依那普利治疗组），10只/组，与空白对照组，共6组。

2.3 各组药物 均以混悬液灌胃。阳性药物（依那普利）对照组、土鳖虫水提物组、土鳖虫脂取物、复方益肾胶囊组每次分别 0.2 mg/只、2.5 mL/只、2.0 mL/只、2胶囊/只，2次/d灌胃；空白对照组和糖尿病模型组灌胃等量生理盐水；各组每日灌胃2次，连续6周。

2.4 观测指标 尿微量白蛋白（MALB）；血肌酐和尿素氮；肾脏组织病理检查。

2.5 标本采集与检测 12周末测大鼠体质量、饮水量，置大鼠于代谢笼中收集24 h尿液，测其总量，取出1～3 mL备用，采用比色法测定尿蛋白含量，换算24 h尿蛋白量。大鼠禁食不禁水12 h，各组随机选8只经5%戊巴比妥钠麻醉后，心脏取血，测定大鼠空腹血糖，血肌酐和尿素氮。剖腹取出左肾、自肾门处切成两片，10%中性甲醛固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，连续4 μm切片，固定于载玻片上，进行PAS染色，光镜病理检测。

2.6 统计学方法 采用SPSS软件分析系统处理结果，数据用均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析。

3 结果

实验过程中,复方益肾胶囊组10只、糖尿病模型组10只（2只死亡），糖尿病模型组表现出典型的多食、多饮、多尿、明显消瘦，皮毛无光泽。

3.1 糖尿病肾病肾小球的病理改变 肾脏外观可见各造模组大鼠肾脏体积增大，皮质增厚而苍白，肾乳头坏死、脱落。PAS染色显示肾小球肥大，肾小球基底膜和肾小管基底膜增厚。肾小球系膜基质增多；肾小球出现无细胞性结节状硬化（K－W结节形成）。肾小球毛细血管袢的纤维素样或类脂样帽状病变。肾小球毛细血管微血管瘤形成；肾小球入球小动脉和出球小动脉玻璃样变。提示糖尿病肾病模型制备成功。复方益肾胶囊组对上述病变均有改善。见图1。

3.2 对大鼠空腹血糖、体质量、肾功能、24 h尿蛋白定量的影响

3.2.1 复方益肾胶囊对大鼠空腹血糖、体质量的影响 见表1。

表1 复方益肾胶囊对大鼠空腹血糖、体质量的影响（±s）Tab.1 Effect of compound tonifying kidney capsule on blood-fasting sugar and body weight in rats（±s）

表1 复方益肾胶囊对大鼠空腹血糖、体质量的影响（±s）Tab.1 Effect of compound tonifying kidney capsule on blood-fasting sugar and body weight in rats（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与糖尿病模型组比较，*P＜0.05 ，**P＜0.01；与阳性对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别空白对照组糖尿病模型组土鳖虫水提物组土鳖虫醇取物组复方益肾胶囊组阳性药物对照组n 108991010体质量（g）334±5.1180±4.8△△212±5.2△△*▲258±5.6△△**282±4.9△**▲268±5.3△△**空腹血糖（mmol/L）5.67±0.3421.32±2.42△△19.76±2.52△△*▲16.23±2.23△△**▲▲13.46±1.87△△**▲▲20.68±2.31△△

由表1可见，糖尿病肾病模型组大鼠空腹血糖持续升高,日饮水量增多,尿量增多，体质量减少，与空白对照组比较均有非常显著性差异（P＜0.01）；土鳖虫脂取物组、复方益肾胶囊治疗组的大鼠空腹血糖明显降低，与糖尿病模型组、阳性药物对照组比较差异显著（P＜0.01）；土鳖虫水提物组也有一定程度降低血糖（P＜0.05）；阳性药物依那普利无明显降血糖作用。

3.2.2 复方益肾胶囊对大鼠肾功能、24 h尿蛋白定量的影响 见表2。

由表2可见，糖尿病肾病模型组大鼠24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮明显增加，与空白对照组比较有显著差异（P<0.01），复方益肾胶囊治疗组24 h尿蛋白、血肌酐明显下降，与糖尿病模型组比较均有非常显著性差异（P＜0.01）；土鳖虫脂取物组对肾功能（24 h尿蛋白、血肌酐）有一定程度改善（P＜0.05），土鳖虫水提物组对肾功能无改善；复方益肾胶囊组和阳性药物对照组对尿素氮有降低（P<0.05），但其他治疗组不明显。说明提示复方益肾胶囊在减少尿蛋白、血肌酐、尿素氮方面优于土鳖虫水提物组和土鳖虫脂取物组，而与阳性药物对照组相近。

表2 复方益肾胶囊对大鼠肾功能、24 h尿蛋白定量的影响(±sTab.2 Effect of compound tonifying kidney capsule on the function of the kidney and protein quality for 24 h(±s

表2 复方益肾胶囊对大鼠肾功能、24 h尿蛋白定量的影响(±sTab.2 Effect of compound tonifying kidney capsule on the function of the kidney and protein quality for 24 h(±s

注：与空白组比较，△P<0.05，△△P<0.01;与糖尿病模型组比较，*P<0.05 ，**P<0.01；与阳性对照组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01 。

组别空白对照组糖尿病模型组土鳖虫水提物组土鳖虫醇取物组复方益肾胶囊组阳性药物对照组10 n 1089910血肌酐（μmol/L）45.20±3.1567.46±4.18△△62.48±3.79△△▲▲54.62±3.18△△*▲51.58±1.39△△**51.27±3.25△△**尿素氮（mmol/L）6.67±1.3419.89±2.56△△19.28±2.26△△▲19.81±2.48△△▲18.67±2.38△△*18.58±2.53△△*尿蛋白（mg/24 h）7.58±3.1227.23±3.47△△23.58±3.56△△*▲▲20.46±3.43△△**▲16.56±3.58△△**16.83±3.28△△**

4 讨论

尿蛋白是各种肾脏疾病进展为终末期肾病的危险因素,DN是引起慢性进展性肾病最重要的原因[5]。尿蛋白的增多与糖尿病肾病的进程密切相关,DN的基本病机为气虚血瘀,并且贯穿于疾病的全病程，其机制主要与肾小球上皮细胞受损和数量的减少有关[6]。中医学认为，2型糖尿病主要以气阴两虚为主，在治疗方法多以益气、滋阴的药物为主，而忽略了对其并发症的治疗，本课题研究主要针对其并发症肾病的实验研究，根据中医络脉理论和络病学说中“久病入络”、“久病入血”、“久病入肾”及“病入络为瘀”的观点，现代研究所证实糖尿病血管病变存在瘀血阻络的病理改变的特点，以及中医的“久病伤阴，阴损及阳”的特点[7]，笔者认为肾络瘀阻，阴阳两虚是DN微血管病变的病机。因此笔者根据中医方剂药物配伍理论，以张仲景名方金匮肾气丸为基本组成，加以活血化瘀药组成复方益肾胶囊,主要功效为化瘀散结，益气扶正。王怡等[8]利用多种方法测定了5种虫类药对血液流变性的影响，结果显示土鳖虫对血液流变性各参数的改善作用最强；同时土鳖虫还可降低血脂。以活血化瘀药土鳖虫为君药,以山茱萸、桂枝、熟地黄、枸杞等养阴助阳中药为辅药，从整体上来治疗DN微血管病变。

研究结果表明，DN动物模型的血糖持续升高，日饮水量增多为正常鼠的8～9倍；尿量增多约为正常鼠的10～11倍，体质量减少，符合糖尿病的“三多一少”特型特征;同时尿白蛋白显著增多，表现为糖尿病肾损伤的症状。各造模组大鼠血尿素氮升高，病理检测呈现弥漫性糖尿病肾小球硬化症和结节性糖尿病肾小球硬化症。复方益肾胶囊治疗后模型大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐明显下降,饮水量和尿量显著减少，体质量增加，依那普利治疗组饮水量和尿蛋白显著减少,血糖和尿量没有明显变化;复方益肾胶囊和依那普利对降低DN模型大鼠升高的血尿素氮有一定作用。提示复方益肾胶囊有降低血糖、减少尿蛋白、血肌酐、尿素氮、减少DN大鼠饮水量和尿量的作用。

[1]中华医学会糖尿病分会慢性并发症调查组.1991-2000年全国住院糖尿病患者慢性并发症及相关大血管病变回顾性分析[J].中华医学科学院学报，2002，24（5）：447-451.

[2]黎磊石.进一步重视糖尿病的防治研究[J].中华医学杂志，1999，7（9）：327-328.

[3]周迎生，高 岩，李 斌，等.高脂喂养联合联合链尿佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征[J].中国实验动物学报，2005，13（3）：154-158.

[4]马淑珍,杜 鹃,马俐儒.链尿佐菌素诱导糖尿病大鼠血尿渗透压的变化极其意义[J].中国实验诊断学,2008,8(12):977-978.

[5]张丽芬,赵进喜,吕仁和，等.糖尿病肾病肾功能不全防治优化方案的有效性和安全性研究[J].中医杂志,2006,47(10):755-756.

[6]陈济德，司延林.糖肾复原汤对大鼠早期糖尿病肾脏损害疗效的实验研究[J].基础研究,2008,24(8):30-31.

[7]雷 艳，黄起福，王永炎，等.论瘀毒阻络是络病形成的病理基础[J].北京中医药大学学报,1999,22(2):8-9.

[8]王 怡.动物类活血化瘀药对血液流变性作用的比较研究[J].中药药理与临床 1997，13（3）：1-4.