五田保肝液对酒精性肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1表达影响的实验研究*

宋星星 ，苏金玲 ，毕业东 ，于建江 ，范英昌

（1.天津中医药大学病理教研室，天津 300193；2.天津市汉沽区中医医院，天津 300480）

近年来，中国饮酒人数增多，尤其是长期、大量饮酒对饮酒者的健康危害巨大，而最严重的是发展为酒精性肝纤维化、肝硬化。因此，开发预防、治疗酒精性肝纤维化的药物具有重要的意义。天津市汉沽区中医医院经过多年研究，研制的现代中药制剂“五田保肝液”由田基黄、垂盆草、败酱草等药物组成，是针对酒精性肝病（ALD）进行治疗的方剂，广泛用于预防和治疗酒精性肝炎、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化，具有清热解毒利湿、活血化瘀的功效，但其发挥作用的分子机制仍不清楚。本实验通过构建大鼠酒精性肝纤维化模型，并检测血清Ⅲ型前胶原蛋白肽（PⅢP）、层黏连蛋白（LN）等肝纤维化血清学指标和检测肝组织转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA的表达，探讨五田保肝液对酒精性肝纤维化是否有干预作用以及与TGF-β1的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠100只，雄性，体质量180～220 g，由北京科宇动物养殖中心提供。饲养于天津中医药大学实验动物中心（环境设施符合《中华人民共和国卫生部实验动物标准》二级标准）。

1.1.2 主要试剂 五田保肝液：由深圳市三九现代中药有限公司提供（由田基黄、垂盆草、败酱草、丹参、五味子、山楂、草决明、泽泻、柴胡、生甘草水煎煮，浓缩、干燥、制成单味中药配方颗粒，以质量按6∶6∶4∶4∶3∶3∶3∶2∶2∶1 的比例配成水溶液。质量标准《中药材生产质量管理规范（试行）》（GAP）。易善复(多烯磷脂酰胆碱胶囊)，由北京赛诺菲安万特制药有限公司生产。62°牛栏山二锅头，由北京顺鑫农业股份有限公司生产。吡唑，购自上海晶纯试剂有限公司。玉米油，购于中粮食品营销有限公司。大鼠LN及PⅢP酶联免疫检测法（ELISA）试剂盒，购于美国RB公司。丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒，购于中生北控生物科技股份有限公司；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒，购于大连宝生物。RNA-Solv Reagent试剂盒，购于美国Omega公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酒精性肝纤维化大鼠模型建立[1]及给药 100只Wistar雄性大鼠适应性饲养1周，分为正常对照组（N组）10只、模型组（M组）、中药低剂量组（WⅠ组）、中剂量组（WⅡ组）、高剂量组（WⅢ组）、阳性药易善复对照组（Y组）各18只。M组、WⅠ组、WⅡ组、WⅢ组、Y组大鼠均以62度牛栏山二锅头酒[10mL/（kg·d）]、玉米油[2mL/（kg·d）]、吡唑[25mL/（kg·d）]混合物灌胃，2次/d，早晚各1次。WⅠ组、WⅡ组、WⅢ组大鼠于两次灌胃之间分别给予五田保肝液0.51 g，1.02 g（成人等剂量），2.04 g/（kg·d）灌胃；Y组和M组大鼠于两次灌胃之间给予相当于成人等剂量的易善复0.12 g/（kg·d）水溶液和相应剂量的生理盐水灌胃，N组则每日3次以相应剂量生理盐水灌胃。各组大鼠实验期间均予全价营养颗粒饲料喂养，自由进食饮水。造模时间为12周。

1.2.2 标本采集 末次给药后禁食，隔夜，次日上午处死大鼠，处死前内眦静脉取血，分离血清为ELISA备用；从每只大鼠肝左叶的相同部位取部分组织用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片后，进行常规苏木精-伊红（HE）和Masson染色；另从肝右叶的相同部位取小块组织迅速存于-70℃冰箱，为实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）备用。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 组织病理学指标检测 常规HE染色观察肝脏病理学改变，Masson染色观察肝纤维化情况。

1.2.3.2 血清学指标检测 ELISA法检测PⅢP、LN，均按试剂盒说明书操作。

1.2.3.3 实时定量RT-PCR方法检测肝组织TGF-β1表达 1）采用RNA－Solv Reagent试剂盒提取肝组织（50－100 μg）总 RNA。2）依试剂盒说明书，采用SYBR Prime ScriptTMRT－PCR Kit试剂盒，以 Random 6 mers和 Oligo Dt Primer为引物将总 RNA（500 ng）反转录为 cDNA（10 μL 体系）。3）以 500 ng的 cDNA产物用作定量PCR扩增的模板，采用SYBR Prime－ScriptTMRT-PCR Kit试剂盒和以相应基因的特异性引物进行PCR扩增，看家基因GAPDH为内参，数据采用2-△△CT相对定量法分析。

引物设计：GAPDH的上游引物为5′-CCCCCA ATGTATCCGTTGTG-3′,下游引物为 5′-TAGCCCA GGATGCCCTTTAGT3′；TGF-β1 的上游引物为 5′-CACCATCCATGACATGAACCG-3′，下游引物为 5′-TTGGTATCCAGGGCTCTCCG-3′。

1.2.4 统计方法 用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，所有资料以均数±标准差（±s）表示，比较均采用单因素方差检验，以P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡情况 正常组大鼠健康状况良好，实验过程中无一只死亡。其他各组大鼠均有死亡，多由乙醇误入气管或急慢性乙醇中毒导致。实验结束后各组剩余大鼠为：正常组10只，模型组8只，五田保肝液低剂量组10只，中剂量组9只，高剂量组10只，阳性药组9只。

2.2 肝组织病理形态学改变

2.2.1 肝组织HE染色结果HE染色显示正常组大鼠肝组织形态结构完整，肝细胞排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状，无明显病变。模型组大鼠大量肝细胞内出现脂滴，大量点状、灶状坏死伴有炎细胞浸润，嗜酸性变多见；五田保肝液各治疗组与易善复治疗组肝组织脂肪变性、坏死、嗜酸性变与模型组比较均有不同程度的减少。

2.2.2 肝组织Masson染色结果正常组大鼠Masson染色显示仅有少量胶原表达；模型组大鼠可见汇管区和中央静脉周围有较多的胶原纤维增生，呈放射状向外延伸，但未相互连接形成间隔，在肝细胞周围、肝血窦、狄氏间隙亦有少量胶原表达；五田保肝液各治疗组与易善复治疗组肝组织胶原表达均有不同程度减少，以五田保肝液中、高剂量组和易善复组明显，汇管区和中央静脉周围纤维化少见。

2.3 大鼠血清PⅢP、LN水平 见表1。

表1 五田保肝液对酒精性肝纤维化大鼠血清LN和PⅢP的影响(±sTab.1 Effect of Wutian Baogan solution on LN and PⅢP in rats with of alcoholic liver fibrosis(±sμg/L

表1 五田保肝液对酒精性肝纤维化大鼠血清LN和PⅢP的影响(±sTab.1 Effect of Wutian Baogan solution on LN and PⅢP in rats with of alcoholic liver fibrosis(±sμg/L

注：与N组比较#P＜0.01；与M组比较*P＜0.01。

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模型组大鼠血清LN和PⅢP水平较正常组显著升高（P<0.01），其他各组大鼠血清LN和PⅢP水平较之模型组降低明显（P<0.01）。

2.4 大鼠肝组织TGF-β1的表达 见表2。

表2 五田保肝液对酒精性肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达的影响Tab.2 Effect of Wutian Baogan solution on TGF-β1mRNA expression in rats with alcoholic liver fibrosis

结果表明：模型组及各治疗组TGF-β1的mRNA表达均高于正常组，差异有显著性（P＜0.01）；模型组TGF-β1的mRNA表达高于五田保肝液各剂量组和易善复组，差异有显著性（P＜0.01）。

3 讨论

中医古代文献对过度饮酒而引起的一系列病证有全面的认识，其中《诸病源候论》所述“酒癖”与酒精性肝纤维化相符，认为是过度饮酒，酒、饮停滞于胁肋下，结聚成癖[2]，因此，在酒精性肝纤维化的治疗上不但要清热利湿解毒，更要注重解散瘀结。本实验所用五田保肝液中田基黄清热利湿，解毒、散瘀、消肿、止痛，垂盆草清热解毒、利尿消肿共为君药，以解湿热酒毒。败酱草清热解毒，排脓破瘀、丹参活血祛瘀共为臣药，助君药清热利湿，并能活血化瘀。酸入肝，五味子、山楂味酸能收敛肝阴，山楂亦能活血化瘀，草决明清肝热、利水，泽泻利水渗湿、泄热，共为佐药。柴胡主入肝经，引诸药入肝经，为引经药。《金匮要略》曰：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾。”甘草味甘补脾、又能解毒，调和诸药，与柴胡共为使药。总之，五田保肝液作为一种新型的保肝中药制剂是否具有抗酒精性肝纤维化作用及其作用效果的可能机制是否与TGF-β1有关是本实验研究的目的。

目前肝纤维化具体机制还不明确，一般认为其发生主要是某些细胞因子使肝星形细胞激活，导致包括胶原、非胶原性糖蛋白、蛋白多糖在内的肝细胞外基质（ECM）合成增多、降解不足，过多的沉积于肝内所致[3]。本实验通过对标志性的肝纤维化血清学指标PⅢP、LN的联合检测从而更全面的反映肝纤维化程度[4]。实验数据显示，五田保肝液各治疗组与模型组比较血清PⅢP、LN水平降低明显（P<0.01），大鼠肝组织HE与Masson染色结果也表明五田保肝液各治疗组在肝组织病变程度与胶原表达方面较模型组有明显减轻，这说明五田保肝液能够有效抑制酒精性肝纤维化的发展，提示其有良好的保肝作用。

转化生长因子β1（TGF-β1）与肝纤维化密切相关，是促进肝纤维化的重要生长因子，在纤维化的发生、发展过程中起关键作用[5]，在本实验中，五田保肝液各治疗组与模型组比较肝组织TGF-β1mRNA表达明显降低（P<0.01），说明五田保肝液在降低血清PⅢP、LN水平的同时降低了TGF-β1mRNA表达，提示五田保肝液可能通过降低肝组织TGF-β1来起到抗纤维化作用。

本实验还发现，中等剂量的五田保肝液降低血清PⅢP、LN水平及TGF-β1mRNA表达效果最好，而高剂量的五田保肝液却略有降低，这说明中等剂量的五田保肝液保肝效果最好，可能原因是五田保肝液的作用效果在中等剂量时达到峰值，其具体机制还须进一步研究。

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