选择性聚乙二醇化赖氨酸的合成*

汪林发， 李同金， 周祖文， 田茂奎， 杨大成

(西南大学 化学化工学院，重庆 400715)

聚乙二醇(PEG)技术是将PEG与治疗性的药物(蛋白质、多肽或小分子化合物)连接以改变被修饰药物的特性。上市的PEG修饰药物与未修饰分子相比，具有半衰期增长、溶解性增加、稳定性增强、酶降解作用减少、免疫原性及抗原性减弱、毒性及用药频率降低等突出优点[1～5]。

赖氨酸及其衍生物是合成多肽类药物的重要中间体，近年来在生物学、药学、医学等方面应用广泛[6～8]。本文拟通过PEG技术将PEG与适宜的赖氨酸联接，制备一些新型的赖氨酸衍生物，期望可以方便地用于某些蛋白质、多肽药物的合成及修饰，获得更安全、疗效更显著的药物分子。

本文选用Fmoc-Lys(Boc)-OH(1)为起始原料，经过羧基苄酯化、侧链Boc脱除和ε-氨基丁二酸酐修饰得到功能化的赖氨酸化合物N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸)-L-赖氨酸苄酯(4)；1和4再分别与单甲氧基聚乙二醇(mPEG-6000，简称mPEG)在偶联剂的作用下联接，最终分别实现了赖氨酸主链和侧链的mPEG定点修饰，合成了新型的N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸聚乙二醇酯)-L-赖氨酸苄酯(5，总收率52．6%， Scheme 1)和N-ε-叔丁氧羰基-N-α-芴甲氧羰基-L-赖氨酸聚乙二醇酯(6,收率93.7%, Scheme 1),其结构经1H NMR， IR和MS表征。各步反应收率在78.5%～93.4%，后处理较为简便。5和6已经成功应用在后续的多肽PEG修饰[9,10]研究中。

Scheme1

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

北京福凯仪器有限公司X-6型精密显微熔点仪；美国AV-300型核磁共振仪(CDCl3/DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；美国GX型FT-IR红外光谱仪(KBr压片)； 美国Agilent 1946B ESI-MS型质谱仪。

1和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)，分析纯，成都凯泰新技术有限责任公司；溴化苄，分析纯，上海试剂三厂；丁二酸酐，化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司；N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)，分析纯，山东淄博畅顺工贸有限公司；二异丙基乙二胺(DIPEA)，化学纯，浙江新德化工有限公司；mPEG，分析纯，北京百灵威；4-二甲氨基吡啶(DMAP)，分析纯，爱斯特医药技术有限公司；其余所用试剂均为市售分析纯。

1．2 合成

(1)N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸苄酯(2)的合成

在圆底烧瓶中依次加入1 5.154 g(11 mmol)， EtOAc 15 mL及Et3N 1.5 mL(11 mmol)，搅拌使其溶解；缓慢滴加溴化苄2.2 mL(12 mmol)，滴毕，回流反应5 h；室温搅拌约11 h。抽滤，滤液依次用0.5 mol·L-1NaHCO3溶液(2×10 mL),饱和NaCl溶液(3×10 mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压蒸馏得粗品6.278 g。经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=2 ∶1]纯化得白色固体2 5.740 g，收率93.4%, m.p.78.5 ℃～79.4 ℃；1H NMRδ: 1.29～1.32(m, 2H, c-H)， 1.43(s, 9H, CH3), 1.51～1.64(m, 2H, d-H), 1.67～1.95(m, 2H, b-H), 3.04～3.09(m, 2H, d-H), 4.13(t,J=6.1 Hz, 1H， a-H), 4.24～4.47(m, 3H, CO2CH2CH)， 5.18(s, 2H, PhCH2)，7.42～7.26(m, 9H, ArH), 7.60(d,J=7.5 Hz, 2H， ArH), 7.76(d,J=7.5 Hz, 2H， ArH); IRν: 3 352, 2 964, 1 749, 1 719, 1 690, 1 528, 1 268, 1 252， 1 173, 738， 697 cm-1； ESI-MSm/z(%): 559{[M+1]+, 25}, 581{[M+23]+, 70}。

(2)N-α-芴甲氧羰基-L-赖氨酸苄酯盐酸盐(3)的合成

在圆底烧瓶中加入2 560 mg(1 mmol)和饱和HCl-EtOAc溶液6 mL，搅拌下于室温反应1 h左右；打开瓶塞，搅拌至无白烟冒出；减压旋蒸，残余液用乙酸乙酯(2×5 mL)洗涤；加入冰乙醚，析出淡黄色固体，抽滤，滤饼真空干燥得粗品，经硅胶柱层析[用V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) ∶V(丙酮)=2 ∶1 ∶1～1 ∶1 ∶1作梯度洗脱]纯化得白色固体3 0.433 g,收率87.8%， m.p.119.9 ℃～120.9 ℃;1H NMRδ: 1.26～1.64(m, 6H, b,c,d-H), 2.84～2.91(m, 2H, e-H), 4.10(m, 1H, a-H), 4.25～4.48(m, 3H, CO2CH2CH), 5.12(s, 2H, PhCH2)， 7.28～8.18(m, 13H, ArH), 8.24(s, 3H, NH3); IRν: 3 323, 2 962, 1 720, 1 689, 1 526, 1 272, 1 251， 1 170, 737， 688 cm-1； ESI-MSm/z(%): 459{[M-HCl], 34}, 460{[M-HCl+1]+, 45}。

(3) 4的合成

在圆底烧瓶中加入3 494 mg(1 mmol)和二氯甲烷5 mL，搅拌下滴加Et3N 153 μL(1.1 mmol)，滴毕，于室反应30 min。依次加入丁二酸酐0.156 g(1.5 mmol)，吡啶121 μL(1.5 mmol)，于室温反应(TLC监测)。用0.5 mol·L-1盐酸(2×15 mL)洗涤后分出有机相，水相用二氯甲烷(2×10 mL)萃取；合并有机相，减压蒸馏，加冰水(30 mL)后析出固体,抽滤得粗品538 mg，经硅胶柱层析(洗脱剂:A=2 ∶3)纯化得白色固体4 0.469 g，收率78.5%， m.p.131.4 ℃～132.8 ℃；1H NMRδ: 1.31～1.69(m, 6H, b,c,d-H), 2.41～2.64(m, 4H, f,g-H), 2.84～2.90(m, 2H, e-H), 3.19～3.22(m, 2H, e-H), 4.02～4.07(m, 1H, a-H), 4.23～4.39(m, 3H, CO2CH2CH), 5.12(s, 2H, PhCH2), 7.33～7.78(m, 13H, ArH), 10.3(s, 1H, CO2H)； IRν: 3 318, 2 954, 1 737, 1 689, 1 270, 1 257, 1 179, 737, 696 cm-1; ESI-MSm/z(%): 559[M, 24], 560{[M+1]+, 52}。

(4) 5的合成

在圆底烧瓶中加入4 278 mg(0.5 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，冰浴冷却，搅拌下依次加入DIC 82 mg(0.6 mmol), HOBt 76 mg(0.6 mmol)和DIPEA 81 mg(0.6 mmol)，反应30 min后撤去冰浴，再依次加入mPEG 3.0 g(0.5 mmol)和DMAP 7.0 mg(0.06 mmol)，室温反应(TLC监测)。减压蒸馏，残余液加冰乙醚30 mL，析出白色固体，抽滤得粗品3.820 g，用混合溶剂[V(二氯甲烷) ∶V(乙醇)=1 ∶1]重结晶得白色固体4 2.780 g，收率84.8%, m.p.55.1 ℃～56.2 ℃； IRν: 3 316, 2 961， 2 888, 1 737， 1 702, 1 561, 744 cm-1。

(5) 6的合成

在圆底烧瓶中加入1 558 mg(1 mmol)和二氯甲烷10 mL，冰浴冷却，搅拌下依次加入DIC 0.152 g(1.2 mmol)和HOBt 162 mg(1.2 mmol)，搅拌30 min后撤去冰浴，依次加入mPEG 6.00 g(1 mmol)和DIPEA 155 mg(1.2 mmol)，室温反应(TLC监测)。加水5 mL，抽滤,滤液用二氯甲烷萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏。残余液加冰乙醚60 mL，抽滤，滤饼用混合溶剂[V(DMF) ∶V(Et2O)=1 ∶8]重结晶得白色粉末6 6.043 g，收率93.7%， m.p.56.9 ℃～59.8 ℃； IRν: 3 317, 3 066, 2 959, 2 887, 1 720, 1 705, 1 688, 1 579, 743 cm-1。

2 结果与讨论

为了得到长效多肽类药物，目前各国学者主要采用化学修饰、基因融合、点突变及制剂改变等方法，其中化学修饰以其灵活多样、简便易行的特点而得到了广泛的应用[11]。在使用的众多修饰剂中,PEG应用最为普遍[12,13]。为此作者设计了主链、侧链经PEG修饰的新型赖氨酸衍生物5和6的合成。为了提高5和6的产率，本文对合成2～5的实验条件进行了优化。

2.1 合成2的条件优化

氨基酸苄酯化的合成方法较多，既可以直接经羧酸和醇的酯化反应(酸催化或偶联试剂促进)、也可用羧酸盐和卤代烃的亲核取代反应合成。作者参照文献[14,15]方法合成2，并对其实验条件进行优化，结果见表1。从表1可以发现，在室温或回流温度下，1与苄溴反应都能生成2，但是室温反应20 h的收率只有50.7%，回流反应5 h的收率就达80.9%；时间延长(9 h)收率稍有提高(85%)；若回流5 h后再在室温反应11 h，不仅收率可超过90%，而且苄溴的气味很淡。放大实验证实了酯化条件的可靠性和稳定性。

2．2 合成3的条件优化

氨基酸脱Boc保护基，常见的试剂有TFA-CH2Cl2， HCl-EtOH及HCl-AcOEt等[14,16]。基于本研究室的经验，采用HCl-AcOEt饱和溶液脱除Boc保护基。实验结果(表2)表明，1 mmol Fmoc-Lys(Boc)-OBzl约需HCl-AcOEt饱和溶液5 mL～7 mL,最佳反应时间为1.5 h。

表1 反应温度和时间对2收率影响Table 1 Effect of reaction temperature and time on yield of 2

an(1 )=n(苄溴)=n(Et3N)=1．1 mmol;bn(1 )=n(苄溴)=n(Et3N)=2.2 mmol;cn(1 )=n(Et3N)=11 mmol,n(苄溴)=12 mmol;dn(1 )=n(苄溴)=n(Et3N)=22 mmol;其余反应条件同1.2(1)

表2 3的制备条件及实验结果*Table 2 Synthetic conditions and corresponding results of 3

*反应条件同1．2(2)

表3 4的制备条件及实验结果*Table 3 Synthetic conditions and corresponding results of 4

*3 1.1 mmol， 其余反应条件同1.2(3)

2.3 合成4的条件优化

赖氨酸侧链引入酰基功能基，既可采用溴乙酸酯，也可选用丁二酸酐，虽然各有优劣，但后者更为方便。本研究采用丁二酸酐法。表3显示，在DCM中，丁二酸酐1.5倍投料，吡啶作催化剂，室温反应4．5 h，收率达78.5%；当反应中不加吡啶催化，即使反应时间延长，收率也会有所降低。

2．4 合成5的条件优化

表4 5的制备条件及实验结果*Table 4 Synthetic conditions and corresponding results of 5

*4 0.5 mmol,n(4) ∶n(DIC) ∶n(HOBt) ∶n(DIPEA) ∶n(mPEG) ∶n(DMAP)=1．0 ∶1．2 ∶1．2 ∶1．2 ∶1．0 ∶0．12；其余反应条件同1．2(4)

羧基和氨基的偶联反应，可选用的偶联试剂很多[16]。本研究试用了DCC/HOBt， TBTU/HOBt， DIC/HOBt和HBTU/HOBt等偶联剂，发现收率相差不大，但后处理却以DIC/HOBt相对简单。本实验参照文献[10,16]的合成方法，实现了5的合成，结果见表4。

高分子修饰的5和6， ESI-MS只得到了分子量范围，但符合高分子的谱图特征；5与4相比，5的IR谱图中νC-H显著增强，而其它位置的吸收峰与4基本一致，由此判定该物质含有较多的CH2CH2结构单元，表明偶联反应成功，确实得到了目标分子5；6的IR谱图(略)中,显示明确的酰胺键、羰基及苯环，并且有很强的νC-H吸收，因此判定该物质是Fmoc-Lys(Boc)-OmPEG。为了得到定量偶联的结果，我们还采用氨基酸树脂替代度测定法(紫外分光光度法)，测定了它们的替代度[17]，得知5和6的替代度分别为0.075和 0.124，这进一步支持了目标分子的结构。

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[17] 一般性方法(以5为例)：称取510 mg加入20%Piperdine-DMF(1 mL)溶液，振荡20 min后再用两个容量管各取DMF(10 mL), 向两管中分别加入200 μL样品溶液和20%Piperdine-DMF溶液；紫外分光光度计测其吸光度，取其301 nm处吸光度,由朗伯-比耳定律算出其替代度；最终可以定量的测出每1克样品中含有多少毫摩尔5