天南星中草酸钙的形态及其对钉螺作用的研究

喻振森，柯文山

(湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉 430062)

血吸虫病是一种严重危害人民健康、影响社会经济发展的寄生虫病[1].钉螺(OncomelaniahupensisGredler)是日本血吸虫(SchistosomajaponicumKatsurade)的惟一中间宿主,抑制钉螺传播扩散是阻断血吸虫病传播的重要手段.目前,杀灭钉螺的主要方法仍然是采用化学药物氯硝柳胺,但该药品种单一,且易造成野外生境破坏.研制高效、价廉、对环境无污染的灭螺药物是国内外学者重点研究课题,其中植物杀螺剂成为其研究的热点[2-4].

天南星(ArisaemaerubescensSchott)属天南星科多年生草本植物，生长于林下阴湿环境，分布广泛，是一种重要药物资源.柯文山等[5]研究证实天南星植物浸出液具有较好的灭螺效果.同时，吴皓等[6]证实天南星植物中的主要刺激性物质为内含的草酸钙针晶.这里以天南星中刺激性物质草酸钙针晶为研究对象，确定其在灭螺过程中所起的作用.

1 材料和方法

1.1实验材料实验用钉螺采自湖北省公安县疫区，经无氯水清洗后，以无氯水饲养.天南星采自湖北省恩施市利川市.

1.2 天南星中草酸钙形态观察

1.2.1 提取草酸钙针晶 参照钟凌云[7]等提取草酸钙针晶的方法作轻微改动，称取50 g天南星干燥块茎，磨成粉末，溶于500 mL水中，然后在600～1 200 r/min转速下，梯度离心，取上清液中层部分，合并干燥，即可获得草酸钙针晶.

1.2.2 确定草酸钙针晶在天南星中的位置 参照杨捷频[8]的实验方法对天南星块茎进行石蜡切片观察.首先取新鲜天南星块茎，切成1 cm3的小块，经过70%的FAA固定，梯度酒精脱水，然后进行浸蜡处理，包埋后按12 μm的厚度进行切片，再用番红染色，最后制成装片封固即可观察.

1.3 草酸钙针晶对钉螺的抑制情况研究

1.3.1 用草酸钙针晶进行灭螺活性检测 将提取草酸钙针晶分别配成5 、2.5 、1 g/L的溶液，用浸杀法进行灭螺实验，每组放10只钉螺；另外取草酸钙化合物配置同样的3个浓度溶液进行灭螺实验作为比较.每组实验重复3次，设置清水对照组，记录钉螺的死亡数.

1.3.2 检测草酸钙针晶对钉螺活动的影响 取直径为20 cm的培养皿，在其上均匀分布放置20个钉螺，并标记放置位置.用配置的5、2.5 g/L的草酸钙针晶和草酸钙化合物溶液滴在钉螺上，剂量以将钉螺刚好浸没液滴为宜，同时以清水为对照.间隔一段时间后测量记录钉螺的爬行距离.

1.3.3 扫描电镜检测钉螺表面损伤情况 将1 g/L的天然草酸钙处理钉螺1、2 d的样品、1 g/L草酸钙化合物处理1 d的钉螺样品以及清水对照的钉螺样品，解剖镜下去壳,取钉螺组织置于2.5%戊二醛、1%锇酸固定，然后经乙醇梯度脱水，乙腈置换，真空干燥，镀金膜，最后在Hitachi S2570 型扫描电镜下观察并拍照.

1.4统计学分析用SPSS17.0软件对两种不同形态的草酸钙的杀螺率进行统计分析.进行多因素方差分析，对不同材料，不同浓度，不同时间的处理均进行显著性差异检测.

2 结果与分析

图1 草酸钙针晶在天南星中的形态特征

2.1草酸钙针晶在天南星植株中的分布及其形态观察由图1(a～c)可以看出，天南星块茎中草酸钙针晶呈簇状分布，即大量草酸钙单晶集体分布某一区域，而且晶体簇的颗粒较大，晶体簇大小一般为天南星体细胞体积的30倍左右，均匀散布于天南星块茎中，并且晶体簇多分布于块茎中的成熟组织中(图1b)，靠近分生组织部分晶体簇相反分布较少(图1a).在图1d中天南星中草酸钙晶体是一种单体针晶，细长，两端尖，经测量长度大约为30～50 μm，一般多数针晶是聚合一起并行排列.

2.2草酸钙针晶的灭螺活性检测由表1可以得出24 h后，5 g/L的草酸钙针晶致死率为63.33%，而2.5 g/L浓度的致死率仅为10%.到72 h后5 g/L的浓度致死率趋近于100%，同时2.5 g/L浓度的致死率达到26.67%.而草酸钙针晶与草酸钙化合物在灭螺效果上相差无几，经方差分析，草酸钙针晶同草酸钙化合物的作用无显著性差异(P>0.05).5 g/L时针晶灭螺率从24 h，48 h到72 h依次是63.33%，80.00%,93.33%;而化合物灭螺率依次是53.33%，73.33%，93.33%，可见两种物质对钉螺都有一定的致死作用.经方差分析，两种物质对钉螺的致死作用较清水水对照均有显著性差异(P<0.05)，同时随着时间的延长致死效果加重.

表1 不同浓度的草酸钙针晶与草酸钙化合物对钉螺的杀螺效果(死亡率/%)

*与清水对照组相比，P<0.05.

2.3草酸钙针晶对钉螺上爬的抑制作用根据钉螺爬行的距离，将钉螺的爬行能力分成不同的等级，假定A1表示钉螺爬动的距离为0 cm，A2表示钉螺爬动距离为0～3 cm，A3表示钉螺爬动距离为3 cm以上.

表2 不同浓度的草酸钙针晶和草酸钙化合物对钉螺上爬的影响 只

由表2的数据可以看出清水中钉螺的爬动情况和用草酸钙化合物处理组的情况相差不大，而且不同浓度的草酸钙化合物对钉螺的爬动影响不大.而草酸钙针晶对钉螺的爬动有较强的抑制作用.这说明，草酸钙针晶对钉螺的活动能力影响效果强，并且低浓度(1 g/L)便能抑制钉螺的爬动.

图2 钉螺扫描电镜图 (图a～d、g、h,bar=7.5 μm；图e,bar=30 μm；图f，bar=17.6 μm)图a、c、e、g分别为清水对照、1 g/L草酸钙针晶处理1 d、1 g/L草酸钙针晶处理2 d、1 g/L草酸钙化合物处理1 d的钉螺肝脏表面扫描图；图b、d、f、h分别为清水对照、1 g/L草酸钙针晶处理1 d、1 g/L草酸钙针晶处理2 d、1 g/L草酸钙化合物处理1 d的钉螺足部肌肉扫描图

2.4草酸钙针晶对钉螺损伤的电镜检测结果正常的钉螺肝脏表面皱褶规律，表面平滑,并且足部肌肉表面皱褶规律(图2a、b)；用 1 g/L的天然草酸钙针晶处理1 d的钉螺肝脏表面，皱褶已趋于平坦，而且表面灰暗，失去原有的光泽，并且足部肌肉突起明显皱缩，应由肌肉收缩引起(图2c、d)；用1 g/L的天然草酸钙针晶处理达到2 d后钉螺的肝脏表面已经出现溃烂现象，皱褶已逐渐凸显，足部肌肉收缩已经有所舒展，但是也出现部分溃烂现象(图2e、f)；1 g/L的草酸钙化合物处理1 d钉螺的肝脏表面皱褶同样趋于平坦，光泽也较淡,其足部肌肉皱褶趋于平坦，光泽也较差(图2g、h).扫描电镜中所表现出来的特征进一步验证了草酸钙针晶对钉螺活动抑制的现象，主要表现为，其致使钉螺足肌皱缩，无法活动.

3 讨论

天南星，别名又称一把伞南星，是多年生草本植物.中医理论[9]认为天南星味苦、辛、性温，有毒，具有燥湿化痰，祛风止痛、散结消肿等功效.柯文山等[5,10]已经研究证实天南星有较好的灭螺效果，并且能有效阻止钉螺的上爬行为,但对天南星植物抑制钉螺上爬的物质尚为未知.同时，吴皓等[11]研究说明天南星属中的刺激性主要是由于其内部含有草酸钙针晶，另外他们还研究证实草酸钙的这种刺激性主要是由于天南星植物中草酸钙针晶的特殊结构造成的，即其草酸钙针晶是一种蛋白质结合草酸钙形成的一种特殊针晶.经过研究发现天南星中的草酸钙晶体是一种单体针晶的形式，在天南星块茎中呈簇状分布(如图1c).在进行草酸钙针晶灭螺活性检测的时候我们发现，草酸钙针晶对钉螺的致死作用并不及其全株的灭螺效果，5 g/L的浓度处理3 致死率才达到93.33%.这种致死效果同草酸钙化合物相差无几，但是经过扫描电镜的检测发现：草酸钙针晶具有草酸钙化合物所不具有的对钉螺具有一定的刺激作用，能使钉螺的肌肉收缩，这同表2中钉螺上爬实验的结论一致：即草酸钙针晶为天南星中抑制钉螺上爬的主要物质.

目前来说，化学灭螺的研究虽然已初见成效，但是氯硝柳氨[12]等化学药物对其他的生物也存在不同的抑制作用，所以人们抑制在探索一种行之有效的植物灭螺途径.皂甙[13-14]，生物碱[15]等植物中提取的物质已经被人们证实具有较强的灭螺活性，但是这类药物有促进钉螺逃逸的现象，所以探索一种既具有灭螺效果，又能将钉螺控制在疫区的灭螺试剂抑制使人们探索的关键.本文中就天南星中提取的草酸钙针晶进行了灭螺测试，发现这种物质能够解决常规灭螺方法导致的钉螺逃逸问题.

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