β -甘露聚糖酶产生菌的鉴定及其粗酶性质的研究

杨升，李立，付权，王行国

(湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉 430062)

β-甘露聚糖酶(β-1, 4-D-mannan mannohydrolase; EC31211178) 是一类降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主链β-1，4-D-甘露吡喃糖的酶[1], 它在利用现存在于一些植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕榈树的坚果、瓜尔豆、洋槐、咖啡树以及魔芋的块茎中的各种β-甘露聚糖有着潜在的重要性[2].按其最适pH值的不同又有酸性、中性、碱性之分.目前，国内外主要用于造纸工业纸浆的漂白[3-4]、油井的破胶、降解植物胶生产低聚糖用作双歧杆菌促生长因子,防病抗衰老的保健食品以及饲料工业中作为抗营养因子[5].微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点.本研究筛选了一株高产偏碱性甘露聚糖酶的菌株,并且对该菌进行初步鉴定以及对其产酶特性和所产甘露聚糖酶的粗酶性质进行了相关酶学性质的研究分析.

1 材料和方法

1.1材料土样采自湖北大学沙湖荒地；T4连接酶、Taq酶、dNTP和DNA marker购自TaKaRa公司，其他生化试剂均为国产分析纯； M9基本培养基、LB培养基见分子克隆[6]；筛选培养基：M9基本培养基中以1%魔芋粉为唯一碳源再加入0.05%曲利本蓝,发酵培养基见文献[7]；16SrDNA引物 5’ AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’；5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’.

1.2环境中产酶菌株的分离取5 g土样加入到100 mL无菌水中混匀浸泡1 h左右,取适量土样悬液稀释,不同梯度分别涂布在筛选培养基中，37 ℃倒置培养，挑取有水解圈的单菌落，并接种于LB液体培养基，37 ℃振摇富集培养过夜.

1.3基因组总DNA的提取和质粒的分离纯化参考分子克隆[6].

1.4 16SrDNA的PCR扩增以提取基因组DNA为模板，用16SrDNA引物进行PCR扩增，循环参数为：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s; 56 ℃ 45 s; 72 ℃ 1.5 min; 30个循环；72 ℃ 8 min.

1.5 DNA的酶切、片段回收、连接和转化DNA酶切参考TaKaRa公司操作说明；DNA片段回收参照V-gene Biotechnology Limited 操作说明进行；连接和转化参考分子克隆进行[6].

1.6粗酶液的制备将菌种接入到LB培养基中,37 ℃、180 r/min培养生长至对数期,按50 mL/L接种量转接到发酵培养基中,37 ℃、220 r/min培养32 h收获发酵液,4 ℃下8 000 r/min离心10 min,收集上清液为粗酶液.

1.7酶活力测定8 mL 0.5%(W/V)瓜儿豆胶溶液50 ℃保温5 min,加入0.1 mL适当稀释的酶液,50 ℃水浴10 min,DNS法测还原糖含量.在上述条件下,每分钟释放相当于1 μmolD-甘露糖的还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U).

2 结果与分析

2.1菌株的分离依1.2方法，以筛选培养基从土样中筛选到15株周围产生透明圈的单菌落，比较菌落直径(C)和透明圈直径(H),取H/C最大的菌株为研究对象，命名为102.并将其产生的粗酶液作用于1%魔芋甘露聚糖和1%瓜儿豆胶,进行TLC后[8]，结果见图1，发现该菌株能明显水解甘露聚糖产生寡糖.

2.2菌株的鉴定采用微生物学标准方法对细菌进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，发现菌株102为革兰氏阳性，有荚膜并产芽孢.根据上述方法提取基因组DNA并扩增出16SrDNA(图2),16SrDNA 的测序比对后发现其与芽孢杆菌同源性达到96%.因此,将菌株102命名为Bacillussp.102.

2.3 粗酶液的性质

2.3.1 不同温度对酶活的影响 底物分别在35、40、45、50、55 ℃下保温5 min,加入0.1 mL酶液,反应10 min后测酶活.得出最适反应温度为50 ℃(图3).

图1 粗酶液水解甘露聚糖TLC图1：葡萄糖, 2：D-甘露糖, 3：粗酶液水解1%魔芋甘露聚糖2 h, 4: 粗酶液水解1%瓜儿豆胶2 h, 5:空白对照.

图2 Bacillus sp.102的16SrDNA PCR图1：λ-EcoT14 I digest, 2:Bacillus sp.102总DNA,3:16SrDNA PCR产物

图3 温度对酶活的影响

2.3.2 酶作用最适pH值 用不同pH值的缓冲液分别配制不同pH值的底物,每支管分别加入8 mL底物保温5 min,加入0.1 mL酶液,反应10 min后测酶活.测得最适反应pH值为9.0,即为弱碱性条件下其酶活性最大.并且在相同的PH条件下，Tris-HCl缓冲液与磷酸缓冲液相比，Tris-HCl对该酶活有抑制作用(图4).

2.3.3 pH值对酶稳定性的影响 粗酶液用不同pH值缓冲液分别稀释50倍,各取10 mL于室温保温3 h,测剩余酶活.发现酶在中性和偏碱性时稳定性较好,酸性条件下酶活降低较快,说明该酶更适合在中性和偏碱性环境发生作用(图5).

2.3.4 温度对酶稳定性的影响 取酶液各5 mL,分别于4、25、37、45、60 ℃保温30 min,测剩余酶活.测得50 ℃保温30 min后酶活剩余81.6%,60 ℃保温30 min后酶活保留26.4%(图6),可见该酶的热稳定性较差.

图4 pH对酶活的影响

图5 pH对酶稳定性的影响

图6 温度对酶稳定性影响

3 讨论

本研究采用平板筛选和液体培养验证酶活的方法,筛选的菌株酶活较高,产酶迅速.而且经过简单的发酵条件优化,该菌所产的粗酶液组分中甘露聚糖酶的成分占了很大的比例,粗酶液的降黏效果明显;粗酶液水解魔芋甘露聚糖和角豆胶的产物均以甘露寡糖为主,这对该酶进一步的分离纯化是一个很大的优势,而且如果应用到对酶纯度要求不高的行业,该菌作为生产菌株会极大地降低生产成本.

试验结果表明该菌株所产粗酶在偏碱性条件下活性及稳定性都高于酸性条件，从而说明该酶在碱性条件下的工业应用拥有一定潜力.

参考文献：

[1] Mc Cleary B V.Comparision of endolytic hydrolases that depolymerize 1,4-β- mannan,1,5-α-L- Arabinan and 1,4-β- galactan [C]//Leatham G F,Himmel M E.Enzymes in biomass conversion,ACS Symposium Series 460.Washington,DC:American Chemical Society,1991:437-442.

[2] Akiro T,Kato C,Horikoshi K.TwoBacillusbeta-mannanases having different COOH termini are produced inEscherichiacolicarrying pMAH5[J].Appl Environ Microbiol,1989,55(12):3178-3183.

[3] Paice M G,Gumagul M,Page D H,et al.Mechanism of hemicellulose-directed prebleaching of kraft pulps[J].Enzyme Microb Technol,1992,14(4):272-276.

[4] Viikari L,Kantelinen A,Ratto M,et al.Enzyme in biomass conversation[C]// Leatham G F,Himmel M E.Enzymes in pulp and paper processing,ACS Symposium Series 460.Washington DC:American Chemical Society,1991: 12-21.

[5] 杨文博,佟树敏,沈庆,等.β-甘露聚糖酶酶解植物胶及其产物对双歧杆菌的促生长作用[J].微生物学报,1995,22(4):204-207.

[6] Sambrook J,Fritsh E F.Molecular cloning: a laboratory manul[M].3nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory,2001:26-98.

[7] 王梅,刘兆辉,江丽华,等.β-甘露聚糖酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究[J].江苏农业科学,2007(6):315-318.

[8] 张敏,史劲松,孙达峰,等.野皂荚多糖胶酶法制备半乳甘露低聚糖的研究[J].研究与探讨,2008,29(9):57-62.