DNA甲基转移酶1在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

张尤历 徐岷 高道键 张玉琦 高军 杜奕奇 龚燕芳 满晓华 李兆申

·论著·

DNA甲基转移酶1在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

张尤历 徐岷 高道键 张玉琦 高军 杜奕奇 龚燕芳 满晓华 李兆申

目的探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。方法收集手术切除的30例胰腺癌组织和配对癌旁组织。采用实时定量PCR法检测DNMT1 mRNA的表达；免疫组织化学法检测DNMT1蛋白的表达；分析胰腺癌组织DNMT1蛋白表达强度与临床病理参数之间的关系。结果胰腺癌组织中DNMT1 mRNA 的表达量为2.32(1.17～5.17)，显著高于配对癌旁组织的0.78(0.07～3.14，P<0.05)。胰腺癌组织中导管细胞DNMT1蛋白表达阳性率为(54.5±21.2)%，显著高于癌旁组织(10.9±15.0)%的表达阳性率(P<0.01)。以胰腺癌导管细胞DNMT1阳性率54.5%为界，分为高表达组(19例)和低表达组(11例)。DNMT1表达强度和临床分期(χ2=6.897,P=0.029)、淋巴结转移(χ2=4.739,P=0.029)、神经浸润与否(χ2=5.44,P=0.020)相关，而与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分化、血清CEA和CA19-9浓度无关。结论胰腺癌组织DNMT1 mRNA和蛋白表达明显增加，DNMT1蛋白表达强度与胰腺癌的侵袭力、淋巴结转移和神经浸润相关。

胰腺肿瘤； DNA甲基转移酶1(DNMT1)； 免疫组织化学

表观遗传学研究DNA甲基化状态、组蛋白修饰、基因组印迹、染色体修饰及microRNA调控状态等问题，其中DNA甲基化是哺乳动物基因组发生的最常见的一种表观遗传学事件。目前DNA甲基化与肿瘤的关系成为肿瘤分子生物学研究的热点之一[1]。DNA甲基转移酶1(DNMT1)是哺乳动物细胞中含量最多的DNA甲基化转移酶，它在多种肿瘤组织中的表达明显上调，其发生往往先于甲基化状态的异常，因而是肿瘤细胞具有特征的早期分子改变[2-3]。本研究检测胰腺癌组织和相应癌旁组织中DNMT1 mRNA和蛋白表达，探讨其在胰腺癌发生、发展中的作用机制。

材料和方法

一、材料

收集2006年1月至2008年3月长海医院手术治疗的30例患者，其中男16例，女14例，年龄38～86岁，平均(59±12)岁。患者术前均未行化疗和放疗，均经病理诊断为胰腺导管腺癌。以第二军医大学胰腺疾病研究所保存的5例正常胰腺组织作为对照。获取组织标本均取得家属同意，并签署书面知情同意书。

二、方法

1．实时定量PCR法检测DNMT1 mRNA的表达：Trizol法提取组织总RNA，用逆转录试剂盒进行逆转录。DNMT1上游引物：5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3′，下游引物：5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′，扩增片段204 bp； GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，扩增片段142 bp。扩增条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，共40 个循环。实验重复3 次。以GAPDH作为内参照。相对表达量(RQ值) = 2-ΔΔCT，以正常胰腺组织DNMT1 mRNA表达量的均数为1，计算癌组织和癌旁组织中DNMT1 mRNA 的相对表达量。

2．免疫组织化学法检测DNMT1蛋白的表达：按SP试剂盒说明书操作。兔抗人DNMT1多克隆IgG抗体(Abcom公司)工作浓度1∶100。PBS代替一抗作为阴性对照，用已知DNMT1表达阳性的胃癌标本作为阳性对照。染色结果判断：胞核染色为阳性。每张切片于高倍镜下随机计数至少500个导管细胞，阳性细胞数/总计数细胞数×100%表示阳性表达率。

三、统计学处理

结 果

一、胰腺癌组织中DNMT1 mRNA的表达

30例胰腺癌组织中DNMT1 mRNA的表达量为1.17～5.17，平均2.32，配对癌旁组织为0.07～3.14，平均0.78，两者相差显著(P<0.05)。

二、胰腺癌组织中DNMT1蛋白的表达

DNMT1定位于导管细胞的胞核，呈棕黄色。胰腺癌内见大量导管细胞表达DNMT1(图1a)，表达阳性率为(54.5±21.2)%，配对癌旁组织仅少数细胞表达(图1b)，阳性率为(10.9±15.0)%，相差显著(P<0.01)。

三、DNMT1蛋白表达强度与临床病理参数的关系

以导管细胞DNMT1表达阳性率54.5%为界，分为DNMT1高表达组(19例)和DNMT1低表达组(11例)。DNMT1蛋白表达强度与临床分期、淋巴结转移、神经浸润相关，而与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分化、血清CEA和CA19-9浓度均无关(表1)。

图1胰腺癌组织(a)和配对癌旁组织(b)中DNMT1蛋白表达(SP ×200)

表1DNMT1蛋白表达强度与胰腺癌患者临床病理参数的关系

参 数DNMT1蛋白高表达(19例)低表达(11例)χ2P值性别(例) 男1060.919 女95年龄(岁)60±1259±130.700肿瘤位置(例) 胰头1481.000 胰体尾53肿瘤大小(cm)4.00(3.25～4.75)3.50(3.13～3.88)0.213临床分期(例) Ⅰ266.8970.029 Ⅱ42 Ⅲ133肿瘤分化(例) 低度340.311 中度145 高度22淋巴结转移(例) 有1334.7390.029 无68神经浸润(例) 有1545.440.020 无47CEA(ng/ml)5.00(1.99～12.59)2.85(1.80～5.55)0.244CA19-9(ng/ml)173.20(6.11～79.85)320.30(46.01～815.55)0.725

讨 论

DNMT家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b，其中DNMT1在细胞中含量最多，起着维持DNA甲基化的作用[4]。

文献报道，胰腺癌、胃癌、肾癌、肝细胞癌、膀胱移行细胞癌、黏液表皮样癌等肿瘤DNMT1蛋白高表达。Peng等[2]报道，胰腺内无明显组织学改变及炎症的组织、有炎症的组织、上皮内瘤变和导管癌组织中DNMT1蛋白的表达依次增加。Wang等[5]报道，DNMT1的高表达与胰腺癌神经浸润、肿瘤分化和肿瘤的TNM分期密切相关。本实验结果显示，胰腺癌组织中DNMT1 mRNA及蛋白的表达明显高于配对癌旁组织，DNMT1表达强度与肿瘤临床分期、淋巴结转移、神经浸润相关，与他们的结果一致。

[1] Esteller M. Epigenetics in cancer. N Engl J Med, 2008, 358:1148-1159.

[2] Peng DF, Kanai Y, Sawada M, et al. Increased DNA methyltransferase 1 (DNMT1) protein expression in precancerous conditions and ductal carcinomas of the pancreas. Cancer Sci, 2005, 96:403-408.

[3] Arai E, Kanai Y, Ushijima S, et al. Regional DNA hypermethylation and DNA methyltransferase (DNMT) 1 protein overexpression in both renal tumors and corresponding nontumorous renal tissues. Int J Cancer, 2006, 119:288-296.

[4] Robert MF, Morin S, Beaulieu N, et al. DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Nat Genet, 2003, 33:61-65.

[5] Wang W, Gao J, Man XH, et al. Significance of DNA methyltransferase-1 and histone deacetylase-1 in pancreatic cancer. Oncol Rep, 2009, 21:1439-1447.

2010-09-16)

(本文编辑：吕芳萍)

ExpressionsandclinicalsignificanceofDNAmethyltransferase1inpancreaticcarcinoma

ZHANGYou-li,XUMin,GAODao-jian,ZHANGYu-qi,GAOJun,DUYi-qi,GONGYan-fang,MANXiao-hua,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

LIZhao-shen,Email：zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the expressions of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) in pancreatic carcinoma and its clinical significance.Methods30 samples of pancreatic cancer tissues and paired para-cancerous tissues were collected from patients who underwent curative pancreatectomy. The levels of DNMT1 mRNA were detected by real-time RT-PCR. Expressions of DNMT1 protein were detected by streptavidin peroxidase immunohistochemistry. The relationships between expression of DNMT1 and clinicopathological findings were analyzed.ResultsThe value of relative quantification (RQ) of DNMT1 mRNA in human pancreatic cancer tissues was 2.32 (1.17～5.17), which was significant higher than 0.78 (0.07～3.14) in para-cancerous tissues(P<0.05). The index of expression of DNMT1 protein in human pancreatic cancer tissues was (54.5±21.2)%,which was significant higher than(10.9±15.0)% in para-cancerous tissues (P<0.01). Patients were divided into the high DNMT1 group (n=19) with above 54.5% of the DNMT1 positively cancer cells and the low DNMT1 group (n=11) with less than 54.5% of the DNMT1 positively cancer cells. The high expression of DNMT1 was correlated significantly with clinical staging (χ2=6.897,P=0.029), lymph node metastasis (χ2=4.739,P=0.029) and neural invasion (χ2=5.44,P=0.020). On the other hand, no association between DNMT1 expression and age, gender, tumor location, tumor size, tumor differentiation, the serum CEA and CA19-9 levels could be found.ConclusionsDNMT1 mRNA and protein was highly expressed in pancreatic cancer tissues. High expression of DNMT1 might be related to the aggressiveness of pancreatic cancer, lymph node metastasis and neural invasion.

Pancreatic neoplasms; DNA methyhransferase 1(DNMT1); Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.012

江苏省自然科学基金(BK2009210)；江苏省卫生厅科研项目(H200836)；镇江市科研计划项目(SH2009012)

212001 江苏镇江，江苏大学附属医院消化科(张尤历、徐岷)；第二军医大学长海医院消化科(高道键、张玉琦、高军、杜奕奇、龚燕芳、满晓华、李兆申)

李兆申，Email：zhsli@81890.net