P选择素在急性坏死性胰腺炎大鼠血小板中的表达

许海玲 黄中伟 薛育政

P选择素在急性坏死性胰腺炎大鼠血小板中的表达

许海玲 黄中伟 薛育政

胰腺炎的发病机制有胰腺自身消化学说、自由基的破坏学说、胰腺的微循环紊乱学说、胰腺腺泡内钙超载学说、白细胞内皮细胞相互作用学说、炎症介质学说，但均无法单独地解释胰腺炎复杂的发病过程及临床表现。本实验检测急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠血小板表面P-选择素的表达，探讨其在重症急性胰腺炎(SAP)发病中的作用。

一、材料与方法

1．实验动物分组及模型制备：48只健康SD大鼠由南通大学实验动物中心提供，雌雄不拘,清洁级，体重(260±10)g。随机分为生理盐水组和ANP组。胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠1 ml/kg体重制备ANP模型，生理盐水组注射等容积无菌生理盐水。术后1、3、6 、12 h分批各处死6只大鼠，取血和胰腺组织。

2．血小板表面P选择素(CD62P)的检测：各时间点抽取的新鲜血液用3.8%枸橼酸钠抗凝，15 min内加入等量新鲜配置的2%多聚甲醛(pH 7.2)固定30 min，室温下800 r/min离心5 min，取上清50 μl，加入1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，1500 r/min离心5 min，弃上清，重复此步骤2次。PBS稀释，血小板计数，调整血小板浓度为10×109/L。取100 μl，加入1 μg(20 μl)FITC标记的羊抗大鼠CD62P抗体(1 μg可检测106个血小板)，室温下避光作用30 min，1 h内上流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)检测，以加PBS作为对照管。获取数据用Cell quset软件分析，得出CD62P阳性血小板百分率及平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。

3．胰腺组织病理学检测：胰腺组织常规石蜡包埋、切片、HE染色，病理科医师盲法按Rongione等[1]的标准进行评分。

二、结果

1．血小板CD62P表达的变化：生理盐水组术后1、3、6、12 h的血小板CD62P阳性百分率分别为(48.5±0.7)%、(55.8±0.1)%、(58.5±0.3)%、(63.4±2.7)%；MFI分别为21.4±0.7、25.8±2.5、35.8±2.7、43.2±3.8。ANP组血小板CD62P阳性百分率分别为(53.3±0.8)%、(71.1±0.9)%、(77.1±2.0)%、(89.1±3.3)%；MFI分别为24.6±1.1、41.4±3.8、48.6±3.5、112.3±6.5(图1)。ANP组CD62P阳性率和MFI均明显高于同时间点生理盐水组(P值均<0.01)。此外，两组血小板表面CD62P阳性率和MFI均呈时间依赖性升高(P<0.05或P<0.01)，术后12 h达到峰值。

2．胰腺组织病理损伤评分：生理盐水组术后1、3、6、12 h的胰腺病理评分分别为0.22±0.17、0.31±0.01、0.41±0.01、0.63±0.01，ANP组分别为3.30±0.10、4.30±0.16、5.46±0.11、9.45±0.13，ANP组均显著高于同时间点生理盐水组(P值均<0.01)，并呈时间依赖性升高(P<0.05)，术后1 2 h达到峰值。

讨论P选择素，即CD62P，是黏附分子家族的成员之一，主要位于血小板、血管内皮细胞膜上。其配体主要表达于中性粒细胞和单核细胞。P选择素与其受体结合可介导白细胞与内皮细胞的黏附，在白细胞趋向感染区域的早期阶段具有重要作用；同时在炎症反应的扩散中起着重要作用。由内皮细胞P选择素介导的血小板在内皮细胞表面滚动参加止血反应[2]，通过活体内显微镜观察，静脉中轴流的血小板紧随着红细胞流动，而靠近血管壁的血小板流速显著比红细胞低，并大多数在内皮表面滚动[3]，这就有利于血小板接近内皮细胞，进一步黏附于破损处，并募集更多的血小板参加聚集反应，可以说是止血反应的前奏。Bertuglia等[4]证实，血小板聚集可导致血液凝固，血栓形成，造成血管堵塞,微循环障碍，在器官功能衰竭中起重要作用。Ishikawa等[5-6]证实，缺血可导致血小板及白细胞聚集，而血小板与白细胞，血小板与血管内皮细胞间的黏附均依赖P选择素及其配体。将ITF持续滴入缺血/再灌注SD大鼠模型静脉内，可导致黏附到血管壁上的血小板及白细胞明显减少，微血管炎症及血小板聚集明显减少[4]。ITF是通过抑制Weibel-Palade小体分泌P选择素发挥这种作用的。

图1ANP组(左列)和生理盐水组(右列)大鼠血小板CD62P阳性表达率及平均荧光强度

本实验结果显示，ANP组血小板表面CD62P的阳性表达率和平均荧光强度(MFI)均明显高于对照组，并随着模型制作后时间的延长而增强，同时胰腺组织病理损伤程度也随着模型制作后时间的延长而加重，提示血小板CD62P的表达与胰腺损伤程度呈正相关。因此，检测血小板表面CD62P也可能作为胰腺损伤程度的指标之一。

[1] Rongione AJ,Kusske AM,Ashley SW,et al.Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in ras.Gastroenterology,1997,112：960-967.

[2] Frenette PS,Moyna C,Hartwell DW,et al.Platelet-endothelial interactions in inflamed mesenteric veneles.Blood,1998,91：1318-1324.

[3] Katayama T,Ikeda Y,Handa M,et al.Immunoneutralization of glycoprotein Ibalpha attenuates endotoxin-induced interactions of platelets and leukocytes with rat venular endothelium in vivo.Circ Res,2000,86：1031-1037.

[4] Bertuglia S,Ichimura H,Fossati G, et al. ITF1697,a Stable Lys-Pro-containing peptide,inhibits weibel-palade body exocytosis induced by ischemia/reperfusion and pressure elevation.Mol Med,2007,13：615-624.

[5] Ishikawa W,Zhang JH,Nanda A,et al.Inflammatory responses to ischemia and reperfusion in the cerebral microcirculation.Front Biosci,2004,9：1339-1347.

[6] Ishikawa M,Sekizuka E,Yamaguchi N,et al.Angiotention Ⅱ type 1 receptor signaling contributes to platelet-leukocyte-endothelial cell interactions in the cerebral microvasculature.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292：H2306-H2315.

2009-06-01)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.024

226000 南通，南通大学附属医院急诊科(许海玲、黄中伟);无锡市第三人民医院消化内科(薛育政)

黄中伟,Email:doctorhzw@yahoo.com.cn