大黄甘草汤对急性坏死性胰腺炎大鼠并发的肺损伤的影响

唐丙喜 邓芝云 孔祥才 陈嘉屿 张方信

·论著·

大黄甘草汤对急性坏死性胰腺炎大鼠并发的肺损伤的影响

唐丙喜 邓芝云 孔祥才 陈嘉屿 张方信

目的观察大黄甘草汤对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠并发肺损伤的治疗效果，探讨其作用机制。方法90只Wistar大鼠按完全随机法分为假手术组、ANP组和大黄甘草汤治疗(治疗)组，每组30只。采用逆行胰胆管注射4%牛磺胆酸钠方法制备ANP模型。治疗组在制模后给予大黄甘草汤(0.25 g/ml)0.6 ml/100 g体重灌胃，1次/12 h；假手术组与ANP组予等量生理盐水灌胃。术后6、12、24 h分批处死大鼠，取胰腺及肺组织行病理学检查并评分；测血清及肺组织IL-6、IL-10、TNF-α水平；免疫组化法检测肺组织Toll样受体4(TLR4)的表达量。结果制模后12 h，假手术组、ANP组和治疗组的血IL-6水平分别为(14.4±4.0)pg/ml、(171.4±41.3)pg/ml、(156.9±34.7)pg/ml，IL-10水平为(13.7±4.5)pg/ml、(120.5±23.7)pg/ml、(148.3±44.4)pg/ml，TNF-α水平为(22.4±4.7)pg/ml、(261.3±51.4)pg/ml、(235.3±45.9)pg/ml；肺组织IL-6水平为(257.3±55.9)pg/g、(2578.3±403.0)pg/g、(2370.0±491.0)pg/g，IL-10水平为(80.8±20.8)pg/g、(642.0±107.3)pg/g、(695.3±151.7)pg/g，TNF-α水平为(207.6±98.6)pg/g、(1769.1±635.6)pg/g、(1401.1±450.5)pg/g；胰腺病理评分为0、7.0±1.3、6.3±1.0；肺脏病理评分为0、6.3±1.4、5.6±1.0；肺组织TLR4表达量为0.09±0.03、0.59±0.09、0.52±0.08。ANP组和治疗组的上述指标均显著高于假手术组(P值均<0.01)；除IL-10外，治疗组的指标又显著低于ANP组(P值均<0.05)。肺组织病理学损伤与胰腺组织损伤呈正相关(r=0.807，P<0.01)，与TLR4表达水平亦呈正相关(r=0.519，P<0.01)。结论大黄甘草汤可快速改善ANP并发的肺损伤，其机制可能与抑制TLR4的表达、降低IL-6和TNF-α、升高IL-10水平有关。

胰腺炎，急性坏死性； 大黄甘草汤； 肺损伤； Toll样受体4； 细胞因子类

重症急性胰腺炎(SAP)常伴发多器官功能障碍综合征(MODS)或多器官功能衰竭(MOF)。其中70%的SAP患者可并发急性肺损伤，相当一部分患者进展为呼吸窘迫综合征(ARDS)，它是SAP患者早期病死的主要原因[1]。祖国医学认为，SAP多由实热积滞、腑气不通所致, 治疗宜采用攻下通腑, 清热解毒之中药。大黄甘草汤具有泻下通便, 活血祛瘀, 逐腐解毒之功,为《金匮要略》中的名方，目前尚未见在SAP患者中应用的报告。本实验观察大黄甘草汤对实验性急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺损伤的影响，探讨其作用机制，为临床应用提供实验依据。

材料和方法

一、动物与分组

清洁级Wistar大鼠90只，由兰州大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重220～280 g。按完全随机法分为假手术组、ANP组和大黄甘草汤治疗(治疗)组，每组30只。假手术组仅开腹后轻翻胰腺组织。ANP组和治疗组采用逆行胆胰管缓慢注入4%牛磺胆酸钠(Sigma公司)0.1 ml/100 g体重的方法制备ANP模型。治疗组于制模后给予大黄甘草汤(0.25 g/ml)0.6 ml/100 g体重灌胃，1次/12 h。大黄甘草汤(大黄12 g，甘草3 g)由我院药剂科提供。其余两组在相应时间点给予等量生理盐水灌胃。术后6、12、24 h分批处死大鼠，腹主动脉采血，离心取血清，置-20℃冰箱；同时取胰尾部胰腺及左、右上叶肺，一部分于液氮新鲜保存，一部分于10%甲醛中固定。

二、检测指标及方法

1．IL-6、IL-10、TNF-α水平检测：采用ELISA方法。试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，按说明书要求操作。

2．胰腺及肺组织病理检查：按常规操作。胰腺组织病理学评分采用改良的Schimidt评分方法[2]，肺组织病理学评分采用经改良的雷文章和Osma标准[3-4]。

3．肺组织Toll样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)蛋白检测：采用免疫组化方法。以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。取3个视野，应用zmage-proplus 5.0软件测量阳性面积光密度值，取均值表示TLR4蛋白相对表达量。

三、统计学处理

结 果

一、血清及肺组织IL-6、IL-10、TNF-α水平的变化

假手术组血清及肺组织IL-6、IL-10、TNF-α水平均无明显变化；ANP组和治疗组血清及肺组织IL-6、TNF-α水平呈时间依赖性逐渐升高，而IL-10水平呈时间依赖性逐渐降低(表1)。ANP组与治疗组IL-6、IL-10、TNF-α水平均较假手术组明显升高(P值均<0.01)；治疗组的IL-6、TNF-α水平较ANP组明显降低(P<0.05)，而IL-10水平则明显升高(P<0.05)。

表1 各组血清、肺组织IL-6、IL-10、TNF-α的变化及胰腺和肺组织病理学评分

注：与假手术组比较，aP<0.01；与ANP组比较，bP<0.05

二、胰腺及肺脏组织病理改变

假手术组胰腺及肺组织结构正常。ANP组光镜下见胰腺弥漫性出血及片状坏死，间质和胰腺小叶大量炎症细胞浸润；肺泡壁破裂，间质充血、水肿、明显增宽，肺泡和肺间质中有大量的中性粒细胞浸润。治疗组光镜下见胰腺细胞变性和腺小叶结构轻度破坏，少量炎症细胞浸润；肺组织轻度水肿，间质轻度充血、水肿，肺泡和肺间质中少量中性粒细胞浸润。各组胰腺及肺组织病理评分见表1。ANP组与治疗组的胰腺及肺组织的病理评分均呈逐渐增加趋势，但治疗组的病理评分较ANP组明显减轻(P值均<0.05)。胰腺组织与肺组织病理评分呈正相关(r=0.807,P<0.01)。

三、肺组织TLR4表达量的变化

假手术组肺组织TLR4表达很低，术后6、12、24 h的表达量分别为0.10±0.04、0.09±0.03和0.10±0.03。ANP组和治疗组肺组织TLR4均呈高水平表达(图1)，两组制模后6、12、24 h的表达量分别为0.46±0.06、0.59±0.09、0.51±0.09和0.43±0.08、0.52±0.08、0.47±0.07，12 h时达峰值。但治疗组均较同时点ANP组明显降低(P值均<0.05)。肺组织TLR4表达水平与其病理评分呈正相关(r=0.519,P<0.01)。

讨 论

IL-6、TNF-α、IL-10作为重要的炎症因子，在SAP 的发生、发展中具有重要作用。Inagaki等[5]报道，IL-6是早期评估急性胰腺炎(AP)严重程度的最佳指标，当IL-6>122pg/ml时，预测SAP及MOF的灵敏性和特异性分别为81.8%和77.7%[6]。TNF-α在AP早期胰腺组织中表达增加，随后也在肺、肝和脾中大量产生，激发一系列级联反应，最终导致胰腺及胰腺外组织的损伤。IL-10作为一种重要的抗炎细胞因子，可抑制Th1细胞的增殖，减少巨噬细胞MHC-2分子的表达，抑制多种细胞因子的合成，是维持细胞因子网络平衡的重要负调节机制。TLR目前被公认为哺乳动物胞外抗原信息传递到胞内的关键跨膜蛋白[7-9]，其中TLR4是最早被发现，也是被研究最多的成员[10]，它在AP发展过程中具有非常重要的促炎作用。缺失该基因的老鼠可明显减轻胰腺炎的严重程度，并可减轻其并发的肺脏损伤[11]，其信号转导过程大体为：脂多糖(LPS)与LPS结合蛋白(LPS bindingprotein，LBP) 结合形成的复合体转运到单核、巨噬细胞膜表面的CD14，借助膜上的TLR4，并在辅助受体MD-2的协助下,通过一系列反应, 最后激活NF-κB，进而诱导多种细胞因子(IL-6、IL-8和TNF-α)、黏附因子、趋化因子的表达。但TLR4的上述作用亦可以不依赖于LPS[11]。在没有感染的情况下，它可介导热休克蛋白70引起全身炎症反应综合征[12]。

图1ANP组(左列)和治疗组(右列)制模后6(上)、12(中)、24 h(下)的肺组织TLR4表达(免疫组化 ×400)

大黄甘草汤是《金匮要略》中的名方。方中大黄性味苦寒，有畅积滞、泻火热、消痈肿、祛瘀血、推陈出新之功；甘草性味甘平，为解诸毒、缓挛急。二者配伍，泻中寓补，通中寓守，相辅相成。本实验结果表明，大黄甘草汤可以快速降低大鼠肺组织TLR4的表达，降低血清及肺组织中IL-6、TNF-α的水平，升高血清及肺组织中IL-10水平，从而改善胰腺及肺组织的损伤，减缓甚至可部分阻断胰腺炎病情的发展。在制模后6 h，肺组织TLR4表达水平即明显升高，12 h达到高峰，之后有所下降，这与文献报道的肝脏、肾脏、小肠中TLR4的表达规律较为一致[13]。肺组织病理学损伤与胰腺组织呈正相关关系，与TLR4表达水平也呈正相关关系，提示肺组织损伤的严重程度可能是伴随胰腺损伤程度而改变，且TLR4在AP相关性肺损伤中具有重要作用。

由于大黄甘草汤可快速减轻ANP时并发的肺损伤症状，且来源广泛，价格低廉，使用方便，可成为治疗SAP的常规辅助药物，值得进一步进行临床研究并推广。

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2009-09-10)

(本文编辑：屠振兴)

EffectofDahuangGancaodecoctiononlunginjurycomplicatedbyacutenecrotizingpancreatitis

TANGBing-xi,DENGZhi-yun,KONGXiang-cai,CHENJia-yu,ZHANGFang-xin.

DepartmentofGastroenterology,SecondMedicalCollege,LanzhouUniversity,Lanzhou730050,China

Correspondinganthor：ZHANGFang-xin,Email：zhangfx2008@tom.com

ObjectiveTo investigate the treatment effects of dahuang gancao decoction on lung Injury complicated by acute necrotizing pancreatitis and explore its mechanism.Methods90 Wistar rats were randomly divided into 3 groups, namely sham-operated group (SO), ANP group (ANP), dahuang gancao decoction treatment group (DG). 4% sodium taurocholate was injected into the pancreatic duct to induce ANP. Dahuang gancao decoction(0.25 g/ml) 0.6 ml/100 g weight was gavaged in the DG group, the same volume of normal saline was gavaged in the SO and ANP group, which was repeated 12 h later. After 6 h, 12 h, 24 h, all rats were sacrificed, pancreas and lung tissues were harvested to observe the pathological changes and the pathological changes were scored. IL-6, IL-10, TNF-α levels of serum and lung tissue were measured, and the changes of toll-like receptor 4 (TLR4) expression in lung tissue was determined by immunohistochemical method.Results12 h after ANP induction, the serum levels of IL-6 in SO, ANP, DG group were (14.4±4.0)pg/ml, (171.4±41.3)pg/ml, (156.9±34.7)pg/ml; the serum levels of IL-10 were (13.7±4.5)pg/ml, (120.5±23.7)pg/ml, (148.3±44.4)pg/ml; the serum levels of TNF-α were (22.4±4.7)pg/ml, (261.3±51.4)pg/ml, (235.3±45.9)pg/ml; the lung tissue levels of IL-6 were (257.3±55.9)pg/ml,(2578.3±403.0)pg/ml,( 2370.0±491.0)pg/ml; the lung tissue levels of IL-10 were (80.8±20.8)pg/g, (642.0±107.3)pg/g, (695.3±151.7)pg/g, the lung tissue levels of TNF-α were (207.6±98.6)pg/g, (1769.1±635.6)pg/g, (1401.1±450.5)pg/g; the pancreas pathological scores were 0, 7.00±1.33, 6.30±0.95; the lung pathological scores were 0, 6.30±1.42, 5.60±0.97; the expressions of TLR4 in lung tissue were 0.09±0.03, 0.59±0.09, 0.52±0.08. The values in the ANP and DG groups were significantly higher than those in SO group (P<0.01);except for IL-10, all values in the DG groups were significantly lower than those in ANP group (P<0.05); there was a positive association between lung and pancreas scores (r=0.807,P<0.01), and lung score was positively associated with the expression of TLR4 (r=0.519,P<0.01).ConclusionsDahuang gancao decoction may quickly improve lung injury complivated by ANP. The mechanism may involve inhibiting the expression of TLR4 and down-regulating the expression of IL-6, TNF-α, up-regulating the expression of IL-10.

Pancreatitis, acute necrotizing; Dahuang gancao decoction; Lung injury; Toll-like receptor 4; Cytokines

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.011

2007年甘肃省自然科学基金项目(ZS076-A23-086-Y)

730050 兰州，兰州大学第二临床医学院消化内科(唐丙喜、孔祥才)；兰州军区兰州总医院检验科(邓芝云)，消化科(陈嘉屿、张方信)

张方信，Email：zhangfx2008@tom.com