新型除草剂(ZJ0777)与牛血清蛋白结合作用的荧光光谱研究

张培敏,郑武杰,吴旭锋,沈莉萍,吴 军

(浙江大学 化学系，浙江 杭州 310028)

0 引 言

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，可与很多内源和外源物质结合，研究药物与血清白蛋白的相互作用，对于了解药物的作用机理具有重要的生物学及临床意义，是一个引人注目的课题[1].而农药分子与蛋白质分子作用特征的荧光法研究的有关报道相对较少.

图1 嘧啶苄胺类除草剂ZJ0777的分子结构Fig. 1 Structures of the ZJ0777

新型除草剂N-(2-溴苯基)-2-(4，6-二甲氧基-2-嘧啶氧基)苄胺[C19H18BrN3O3][简称ZJ0777]是一种新型的嘧啶苄胺类除草剂，可防除冬油菜田的主要杂草，对油菜安全，用量低、活性高，在油菜田中具有较好的应用前景[2].结构式如图1所示.

荧光光谱法具有灵敏度高、选择性高、取样量少、方法简便快速等特点[3]，是研究生物大分子，特别是蛋白质与各种有机小分子、离子和无机化合物相互作用的重要手段.该实验通过荧光光谱技术，研究新型除草剂ZJ0777与牛血清蛋白BSA间的相互作用，探讨了新型除草剂ZJ0777与BSA作用的机制，测定其热力学参数，ZJ0777与BSA作用的结合常数、结合位点数、结合作用力类型.

该文首次用荧光法对新型除草剂ZJ0777与BSA间的相互作用机理进行研究，试图从分子水平了解新型除草剂ZJ0777与蛋白质的结合方式，对明确新型除草剂ZJ0777在动物体内的代谢过程等方面具有重要的意义.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津RF-5301PC型荧光分光光度计(日本，岛津公司)；TB-85超级恒温水浴仪(日本,岛津公司).

N-(2-溴苯基)-2-(4，6-二甲氧基-2-嘧啶氧基)苄胺(ZJ0777)标准品：按文献[2]方法自制，经多次重结晶，纯度达99%以上.

牛血清蛋白(BSA)(上海生物化学制剂厂提供)；Tris(生化试剂)、DMF、氯化钠等均为分析纯；实验用水为超纯水,经检测无荧光杂质.

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

配制pH=7.1,0.05 mol·L-1Tris-HCl缓冲液(内含0.01 mol·L-1NaCl以维持离子强度)；然后用该Tris-HCl缓冲液配制浓度为1.0×10-6mol·L-1的BSA溶液.

用DMF配制浓度为5.0×10-3mol·L-1的ZJ0777溶液.

在10.00 mL容量瓶中依次加入一定量的5.0×10-3mol·L-1的ZJ0777溶液，再均加入3 mL1.0×10-6mol·L-1的BSA溶液，最后均用DMF定容至刻度(其中DMF与H2O的体积比均为7∶3).

1.2.2 实验步骤

1.2.2.1 荧光光谱

分别在14 ℃，25 ℃，35 ℃下，以281 nm为激发波长，在RF-5301PC型荧光分光光度计上记录上述11个溶液在300～400 nm波长范围内牛血清蛋白的发射光谱.

1.2.2.2 同步荧光测定

激发和发射单色器同时进行扫描，改变发射波长λem与激发波长λex之间的波长差△λ,λem=λex+△λ，分别在△λ=20 nm和△λ=60 nm下测定纯BSA以及BSA与ZJ0777不同摩尔比(3∶1 000和1∶1 000)情况下的发射峰强度及峰位.

2 结果与讨论

2.1 ZJ0777对BSA的荧光猝灭光谱

图2 ZJ0777对BSA的荧光猝灭光谱Fig. 2 Fluorescence quenched spectra of BSA by ZJ0777 at different concentrations

BSA分子中因含色氨酸Trp、酪氨酸Tyr等氨基酸残基而发射一定强度的内源荧光.ZJ0777能显著猝灭BSA的荧光强度.实验测得BSA的荧光发射光谱和ZJ0777对BSA作用的荧光猝灭光谱如图2所示.

2.2 ZJ0777对BSA荧光猝灭的作用机理

荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态猝灭和静态猝灭[4].区分荧光猝灭是动态猝灭还是静态猝灭，一是看相互作用物质间是否形成基态配合物，二是依据荧光猝灭常数随温度的变化关系来确定.为了判断猝灭类型，首先假设该猝灭为动态猝灭，按照Stern-Volmer方程:

(1)

由表1得各温度下的动态猝灭常数KSV，通过公式(1)的计算得表2.由表2可以看出各温度下ZJ0777对BSA荧光猝灭的过程速率常数均远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1,即ZJ0777对BSA荧光猝灭的过程速率常数远大于扩散控制的Kq，由此可以推断，猝灭过程为形成化合物所引起的静态猝灭，不是由于分子碰撞所引起的动态猝灭.故用静态猝灭公式——Lineweaver-Burk双倒数方程：

(2)

式中KLB为静态荧光猝灭过程中复合物的形成常数，单位是L·mol-1，它反映了在静态猝灭过程中生物大分子与荧光猝灭剂分子的结合反应达到平衡时的量效关系[6].

图3 BSA的Stern-Volmer曲线Fig. 3 The Stern-Volmer curves of BSA

图4 BSA的Lineweaver-Burk双倒数曲线Fig. 4 The Linewaver-Burk double-reciprocal curves(B) of BSA

表1 直线方程和相关系数

表2 结合常数和热力学常数

2.3 猝灭过程中热力学函数的变化及结合力类型

有机小分子与生物大分子之间的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等,小分子不同，与蛋白质作用力的类型也不同.Ross[7]等根据大量的实验结果，总结了根据反应前后热力学焓变△H和熵变△S的相对大小，可以判断荧光猝灭剂与蛋白质之间的主要作用力类型:若△H>0及△S>0，主要表现在疏水作用；若△H<0及△S>0，主要表现为静电作用；△H<0及△S<0，主要表现在氢键或者van der Waal作用.

式(3)～(5)中△G为吉布斯生成自由能，△H焓变，△S为熵变.当温度变化不大时，结合反应的焓变△H可看成一个常数，根据以下热力学公式可求得ZJ0777与BSA结合的热力学函数值，结果列于表2.

△G⊖=△H⊖-T△S⊖

(3)

△G⊖=-RTlnK⊖

(4)

(5)

该实验中,由表2可知，△G⊖<0，说明反应过程是自发的；△H⊖>0，为吸热反应，升高温度将有利于其向生成ZJ0777-BSA复合物的方向进行，表2中结合常数KLB随温度的升高而增大很好地印证了这一点；又△S⊖>0，从而可以认为ZJ0777与BSA之间的作用力可能主要是疏水作用力.

2.4 结合位点数

金属离子或有机小分子等与蛋白质等生物大分子相互作用位点数可以由

(6)

图5 -log～-logcZJ0777曲线Fig. 5 Plot of -log～-logcZJ0777

2.5 ZJ0777对BSA构象的影响

对于蛋白质的同步荧光，△λ=20 nm时仅显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特征，△λ=60 nm时仅显示蛋白质色氨酸残基的光谱特征[9].因氨基酸残基的最大荧光波长与其所处环境的疏水性有关，所以由荧光波长的改变可判断蛋白质构象的变化.固定BSA的浓度，改变ZJ0777的浓度，△λ=20 nm和△λ=60 nm时的同步荧光光谱见图6.

图6 药物对BSA同步荧光的影响Fig. 6 Synchronous fluorescence spectra of BSA

由图6可知，酪氨酸残基和色氨酸残基的最大发射波长均不变，但是后者的内源荧光强度明显大于前者，这表明BSA的荧光主要由色氨酸残基所贡献，ZJ0777的加入并不改变BSA的构象，药物与BSA之间的作用主要是与色氨酸的作用.

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