高效液相-紫外检测法测定当归中藁本内酯含量

李 平, 李榆梅

(山西生物应用职业技术学院生物制药工程系, 太原 030031)

当归为伞形科(Umbelliferae)植物当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根,入肝、心 、脾经 ,药性甘、辛、温,具有补血活血、祛瘀、调经止痛、润燥滑肠之功效,用于月经不调、贫血、经闭、痛经、崩漏等[1]。当归为临床使用频率最高的中药之一,素有“十方九归”之说。国内外许多学者对当归的化学成分、药理作用以及临床应用均进行了较为详细的研究,当归中含有苯酞类、萜类、芳香族化合物等成分[2-5]。

当归对子宫具有兴奋和抑制“双向性”作用,其兴奋活性物质为水溶性或醇溶性的非挥发性物质,抑制活性物质主要为其挥发油中的藁本内酯(ligustilide)[6,7]。藁本内酯对兔离体子宫,无论早孕或未孕均有明显抑制作用,表现为张力下降、节律变慢、收缩力减弱,几分钟后完全松弛,作用时间持久[8,9]。因此对当归中藁本内酯的含量进行控制是非常必要的。但在现有文献中,藁本内酯的含量测定方法多采用气相色谱法,但气相色谱设备不普及,此外操作复杂,实验成本高,因此本文探索以更常用的高效液相法检测当归中藁本内酯的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AL204型电子天平(瑞士 Mettler Toledo),UV-2102PCS型分光光度计(上海 Unico),LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津公司),KQ250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),arium 611UF超纯水纯化系统(德国赛多利斯公司),PZB-5韦氏比重秤(上海东方科技有限公司)。

1.2 材料与试剂 Hypersil ODS2柱(4.6 mm×200 mm,5μm)(大连依利特分析仪器有限公司),当归药材(上海华宇药业股份有限公司,产地:甘肃)。甲醇、乙腈为色谱纯(Merck公司),其他试剂均为分析纯。藁本内酯对照品由本实验室分离制得,经气相色谱面积归一化法测定,藁本内酯含量为98.3%(g/g)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制 精密称取藁本内酯对照品 11.3 mg,置 50 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,为对照品溶液(Ⅰ),浓度为0.226 mg/ml;精密吸取对照品溶液(Ⅰ)0.5 ml,置于 100 ml量瓶中,以甲醇稀释至刻度,作为对照品溶液(Ⅱ),浓度为0.001 13 mg/ml。

2.2 检测波长的选择 配制一定浓度的藁本内酯甲醇溶液,以甲醇为空白,在 200-450 nm范围内进行紫外光谱扫描,确定检测波长为350 nm。

2.3 色谱条件 Hypersil ODS2柱(4.6 mm×200 mm,5 μm);紫外检测器 ;乙腈-水 (80∶20)为流动相,流速 1 ml/min,洗脱 30 min。

2.4 系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-水(80∶20)为流动相,检测波长为350 nm,色谱柱理论塔板数以藁本内酯计算为10 350,拖尾因子为1.021,色谱峰对称性良好,藁本内酯与其他峰的分离度符合要求,保留时间为14.067 min,见图1。

图1 藁本内酯高效液相色谱图Fig 1 The high performance liquid chromatogram of ligustilide

2.5 线性关系考察 取对照品溶液(Ⅰ)2,10μl,对照品溶液(Ⅱ)4,12,40μl,分别注入液相色谱仪,进样分析,记录峰面积。以进样量(ng)为横坐标,峰面积 A为纵坐标,绘制标准曲线,进行回归分析,回归方程为A=165 4X+494,r=0.999 9,结果见图2。结果表明,藁本内酯在 0-2.26μg的范围内,进样量与其峰面积呈良好的线性关系。

图2 藁本内酯标准曲线Fig 2 Calibration curve of ligustilide

2.6 精密度试验 取对照品溶液Ⅰ,进样 10μl,连续进样 6次,计算平均峰面积及其相对标准偏差,结果见表1。说明该法精密度良好。

表1 藁本内酯精密度试验Tab 1 The results of precision test

2.7 供试品溶液的稳定性试验 取粉碎过 80目筛的当归药材粉末 0.01 g,精密称定,置 10 ml量瓶中,超声 30 min,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;取供试品溶液分别于 0,1,2,4,6,12 h进样分析,记录峰面积,观察供试品溶液的放置稳定性,结果见表2。结果表明,供试品溶液在 12 h内 RSD小于 2%,基本保持稳定。

表2 供试品溶液的稳定性试验Tab 2 The results of stability test

2.8 重复性试验 取同一批号的当归药材共 6份,精密称定,分别以甲醇超声提取 30 min,滤过,将滤液进样分析,结果见表3。结果表明,本方法重复性良好。

表3 重复性试验Tab 3 The results of repeatability test

2.9 加样回收率试验 取同一批号的当归药材,共6份,精密称定,置 10 ml量瓶中,超声 30 min,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液,测定含量;分别精密加入浓度为0.049 42 mg/ml的对照品溶液 2 ml,3 ml和浓度为0.098 83 mg/ml的对照品溶液 2 ml,进行加样回收率的测定。结果表明该方法的准确度良好,见表4。

表4 回收率试验Tab 4 The results of recovery test

2.10 藁本内酯最低检测限及最低定量限的确定取藁本内酯对照品溶液,经多次稀释后进样分析,最后按信噪比 S/N≥3确定藁本内酯的最低检测限为0.002 47μg;按信噪比 S/N≥10确定藁本内酯的最低定量限为4.52 ng。

2.11 当归中藁本内酯的含量测定 取粉碎过 80目筛的当归药材粉末 0.01 g,精密称定,置 10 ml量瓶中,超声 30 min,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另取藁本内酯对照品适量,加甲醇制成0.001 mg/ml的对照品溶液,分别吸取供试品溶液和对照品溶液各 10μl,按高效液相色谱法进样测定,按外标法以峰面积计算含量,藁本内酯的含量分别为1.70%(g/g)、1.66%(g/g)、1.64%(g/g)。

3 讨论

文献报道的有采用气相色谱-质谱法、双波长薄层扫描法测定当归中藁本内酯的含量,而在实际研究工作中,气相色谱仪的普及率远不及液相色谱仪。因此本文探索建立高效液相色谱法测定藁本内酯含量。在色谱条件选择过程中,比较了 C8柱与C18柱,最终确定了对样品分离较好的C18柱;检测器比较了示差、蒸发光散射、紫外检测器,最终确定选用较通用的紫外检测器;在流动相的选择中,比较了不同比例的甲醇-水及乙腈-水系统。确定了乙腈-水(80∶20)为流动相,流速 1 ml/min,洗脱 30 min。在该体系下,藁本内酯色谱峰峰形好,柱效高,甲醇溶剂不干扰测定,样品中藁本内酯与其他峰的分离度符合要求,定量准确。经方法学考察结果表明,本法符合药典规定,灵敏度高,精密度好,可为含有藁本内酯的药材或制剂的质量控制提供依据。

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