气相色谱法测定帕米膦酸二钠中的有机溶剂残留量

张慧兰, 乔学文, 申云飞

(山西康宝生物制品股份有限公司, 长治 046011)

帕米膦酸二钠(APD)为新一代双膦酸盐类骨代谢改善剂,在对骨质生长和矿化无明显不良影响的剂量下,有很强的抑制骨质再吸收作用,国外已用于恶性肿瘤的高钙血症、溶骨性骨转移、佩吉特氏病、骨质疏松症及多发性骨髓瘤的治疗或预防,对恶性肿瘤骨转移所引起的疼痛有显著的止痛作用。帕米膦酸二钠在碳链末端引入氨基,使生物活性大大增强,其抑制骨吸收作用比依屈膦酸钠强 100倍,比氯屈膦酸钠强 10倍。帕米膦酸二钠作为骨吸收抑制剂,用于治疗肿瘤高血钙和恶性肿瘤骨转移,疗效显著,副作用低。该药品 1987年在阿根廷首先上市后,在英、美以及欧洲国家普遍相继上市使用。由于该药在合成过程中使用了有机溶剂甲醇、氯苯,本研究采用气相色谱法,以 50%N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,对帕米膦酸二钠中甲醇、氯苯溶剂残留量进行测定,操作简单,重现性好,可用于该原料药中甲醇、氯苯残留的测定。

1 仪器与试药

岛津 GC-14C型气相色谱仪;FID检测器。帕米膦酸二钠原料药(山西康宝生物制品股份有限公司生产,批号 040401,040402,040403),甲醇、氯苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱 DIMWax毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.50μm);进样口温度为240℃;FID检测器,温度为250℃;柱温 40℃(保持 5 min),以 20℃/min升温至 180℃(保持1 min);载气为氮气;进样量 1μl。在此色谱条件下,理论板数以氯苯计算为5 354,气相色谱图见图1,甲醇、氯苯及溶剂 N,N-二甲基甲酰胺的保留时间约为0.975,5.305,7.772 min,分离度均＞4。空白溶剂 N,N-二甲基甲酰胺对测定不干扰。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取甲醇(15.6 mg)、氯苯(14.5 mg)分别置 25 ml量瓶中,加 50%N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度,摇匀,作为残留溶剂对照品储备液,再分别精密量取甲醇对照品贮备液 5.0 ml和氯苯对照品贮备液 0.6 ml于 10 ml量瓶中,加 50%N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 精密称取供试品 1.0 g于具塞试管中,精密加入 10 ml 50%DMF溶解,滤过,取续滤液,即得。

2.3 精密度试验 取 2.2项下对照品溶液,平行进样 5次,测得甲醇、氯苯峰面积的RSD分别为1.53%和1.08%。

2.4 检测限 分别取甲醇、氯苯对照品储备液稀释制成一定浓度的溶液,进样 1μl,当甲醇、氯苯浓度分别为0.374μg/ml,0.209μg/ml,信噪比约为3,甲醇、氯苯的检测限分别为0.4 ng,0.2 ng。

2.5 标准曲线的制备 分别精密量取甲醇对照品储备液 1.0,2.5,5.0,6.5,8.0 ml和氯苯对照品储备液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml,分别置 10 ml量瓶中,用 50%N,N-二甲基甲酰胺配制成每毫升含甲醇 62.4,156.0,312.0,405.6,499.2μg和氯苯 11.6,23.2,34.8,46.4,58.0μg的标准溶液。照上述色谱条件进样 1μl,记录色谱图,以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归。甲醇 Y=304.87X-7 982.2,r=0.999 2;氯苯 Y=2 727.6X-17 465,r=0.999 4。甲醇和氯苯分别在 62.4-499.2 mg/ml和11.6-58.0 mg/ml的浓度范围内线性关系良好。

2.6 回收率试验 取本品(批号 040401)6份,每份约 1.0 g,置 10 ml量瓶中,再精密加入 2.2项下对照品溶液适量(低、中、高样品,使甲醇和氯苯浓度分别约为249.6,312.0,374.4μg/ml和27.84,34.80,41.76μg/ml),加 50%N,N-二甲基甲酰胺溶解,并定容至刻度,摇匀。依上述色谱条件,精密量取 1μl进样,并记录色谱图,计算回收率及 RSD值,结果见表1,2。

图1 2种有机溶剂及空白溶剂气相色谱图Fig 1 Gas chromatograms of blank(A)and two organic solvents(B)

表1 甲醇回收率试验结果Tab 1 Recovery test of methanol

表2 氯苯回收率试验结果Tab 2 Recovery test of chlorobenzene

2.7 测定结果 取标准对照品溶液与供试三批样品溶液,进样 1μl,进行色谱分析,测定结果见表3。

表3 帕米膦酸二钠有机溶剂残留量的测定结果Tab 3 Contents of residual solvents in pamidronate disodium

3 讨论

3.1 限度的确定 人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)的有机溶剂残留量指导原则中,规定甲醇和氯苯为第二类应该限制使用的溶剂,本文参照中国药典 2005年版二部的指标要求,规定待测溶剂的限度为:甲醇 0.3%,氯苯 0.036%。

3.2 溶剂的选择 由于帕米膦酸二钠为水溶性药物,而待测的有机溶剂氯苯在水中的溶解性不好,故选择 50%N,N-二甲基甲酰胺水溶液做溶剂,这样不仅可以使帕米膦酸二钠充分溶解,还可以使氯苯在 N,N-二甲基甲酰胺充分溶解。

3.3 柱温的选择 本实验采用程序升温的方法,测定时将柱温设定在 40℃保持 5 min,使甲醇和氯苯能很好分离,但溶剂 N,N-二甲基甲酰胺沸点高,故以 20℃/min升温至 180℃,加快 N,N-二甲基甲酰胺出峰。

[1] 钟永祥,张祥斌.帕米膦酸二钠的临床应用进展[J].中华全科医师杂志,2005,4(1):27-29.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社,2005:附录 54-56.

[3] 邓婕,李志良,肖玉梅,等.盐酸帕洛诺司琼中有机残留溶剂的检测[J].药物分析杂志,2007,27(5):735-737.

[4] 朱迎军,李瑞莲,李昌亮.富马酸伊布利特原料中有机残留溶剂的检测[J].中南药学,2008,6(1):70-72.