红花黄色素氯化钠注射液细菌内毒素检查方法的建立

段陈平, 刘 芳, 高天红

(1山西华辉凯德制药有限公司, 晋中 030600; 2山西省药品检验所)

红花黄色素氯化钠注射液用于治疗冠心病稳定型劳累性心绞痛的有效药物,现参照文献[2-4],按照《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢ D细菌内毒素检查法[1]及附录ⅩⅧ B中药注射剂安全性检查指导原则[1],研究红花黄色素氯化钠注射液对细菌内毒素试验的干扰情况,建立其细菌内毒素限量检查的方法。

1 试药与仪器

红花黄色素氯化钠注射液(批号为90301019、90301028、90301031,规格 100 ml/瓶,山西华辉凯德制药有限公司)。细菌内毒素工作标准品(WSE)(批号:2007-5,效价:100 EU/支,中国药品生物制品检定所)。鲎试剂(TAL):厦门鲎试剂厂(批号:071160,λ=0.125 EU/ml,规格为0.5 ml/支 ;批号:0902063,λ=0.03 EU/ml,规格为0.5 ml/支 );湛江博康海洋生物有限公司(批号为0806183,λ=0.125 EU/ml,规格为0.5 ml/支;批号为081125,λ=0.03 EU/ml,规格为0.5 ml/支);湛江安度斯生物有限公司(批号:0710190,λ=0.25 EU/ml,规格为0.5 ml/支);细菌内毒素检查用水(BET水)(批号:2006-12,规格为10 ml/支,中国药品生物制品检定所)。超净工作台(苏州净化设备有限公司);2型旋涡混合器(上海精科实业有限公司);试验所用玻璃器皿均经 250℃干烤至少 1 h。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核 按中国药典 2005年版一部附录ⅩⅢ D细菌内毒素检查法进行,所用鲎试剂的灵敏度测定值 λc均在 0.5λ-2.0λ之间,符合规定,可用于本试验,结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果Tab 1 The TAL sensitive test results

2.2 供试品细菌内毒素限值(L)确定 L=K/M式中 K为按规定的给药途径不同,人每千克体重每小时可接受的内毒素最大剂量,注射剂的K=5 EU/(kg·h),M为人体每千克体重每小时给药的最大剂量,参考使用说明书以红花黄色素计,人用最大剂量为100 ml/次,中国人体重按 60 kg计,M=1.7 ml/kg,L=K/M=3 EU/ml,而大容量注射剂细菌内毒素限值为0.5 EU/ml,本品限值标准定为L=0.5 EU/ml。

2.3 最大有效稀释倍数(MVD) 供试品稀释倍数按公式 MVD=CL/λ计算,其中 L为细菌内毒素限值 0.5 EU/ml,当限值单位为EU/ml时,C为1 ml/ml,λ为鲎试剂的标示灵敏度,目前市面上售鲎试剂灵敏度在 0.5-0.03 EU/ml,经计算,本品 MVD在2-16倍之间。

2.4 供试品干扰试验

2.4.1 供试品干扰预试验 取供试品,加 BET水,分别稀释至 2,4,8,16倍的溶液(记此系列溶液为NPC),并用其分别将内毒素标准品制成含 2λ,0.25λ的一系列浓度(记此系列溶液为PPC),用三个厂家不同鲎试剂(λ=0.125 EU/ml,λ=0.25 EU/ml)考察每个供试品浓度下的干扰情况,并设阴性对照和阳性对照,结果见表2-4。预试验结果表明,红花黄色素氯化钠注射液对三厂家鲎试剂在PPC2(0.25λ)系列反应中,在 2,4倍稀释时均表现为凝集反应,表明本品对鲎试剂的凝集反应表现为增强作用。采用厦门鲎试剂厂与湛江博康海洋的鲎试剂在 16倍稀释时,对鲎试剂的凝集反应无增强或抑制作用;而采用湛江安度斯的鲎试剂在 8倍稀释时,对鲎试剂的凝集反应无增强或抑制作用。所以用 16倍稀释倍数进行供试品干扰试验。

表2 干扰预试验结果 (厦门鲎试剂厂,λ=0.125 EU/ml)Tab 2 Results of preliminary interference test for TAL from Xiamen TAL Ltd. (λ=0.125 EU/ml)

表3 干扰预试验结果(湛江博康海洋生物有限公司,λ=0.125 EU/ml)Tab 3 Results of preliminary interference test for TAL from Zhangjiang Bokang Marane Biological Co.,Ltd.(λ=0.125 EU/ml)

表4 干扰预试验结果(湛江安度斯生物有限公司,λ=0.25EU/ml)Tab 4 Results of preliminary interference test for TAL from Zhanjiang A＆C Biological Ltd. (λ=0.25EU/ml)

2.4.2 供试品干扰试验 根据预试验的结果,用细菌内毒素检查用水分别稀释成 16倍供试品,将内毒素工作标准品制成0.25,0.125,0.06,0.03 EU/ml的一系列浓度,分别用 2个厂家的鲎试剂同时考察 3批供试品每个浓度下的干扰情况,每一浓度做 4管,同时作阴性对照和供试品阴性对照,结果见表5。

表5 供试品干扰试验结果Tab 5 Results of interference test for sample

结果表明,红花黄色素氯化钠注射液采用厦门鲎试剂厂与湛江博康海洋生物制品有限公司的鲎试剂在 16倍稀释时,对鲎试剂的凝集反应无增强或抑制作用,所以确定样品稀释倍数为16倍。

2.5 供试品细菌内毒素检查 按《中国药典》2005年版一部ⅩⅢ D细菌内毒素检查法,取 3批供试品,按 16倍稀释倍数,分别用两个不同厂家的鲎试剂对其进行细菌内毒素检查,结果符合规定,见表6。

表6 供试品细菌内毒素检测结果Tab 6 The results of bacterial endotoxin test

3 讨论

TAL用于细菌内毒素的检测具有操作简单、灵敏度、重现性好、实用性强等优点。由于中药注射剂干扰因素多,本实验也证明,不同厂家的鲎试剂,对红花黄色素氯化钠注射液细菌内毒检查所产生的干扰情况存在着较大差异。就该产品采用灵敏度为0.03 EU/ml的鲎试剂检测时,若干扰程度增加,则该检测方法就不适用[5],因此对于中药注射剂采用细菌内毒素替代热原检查法目前存在较多争议。本文对于红花黄色素氯化钠注射液的细菌内毒素检查方法的建立给中药注射剂采用细菌内毒素法代替热原检查法提供一种参考。

本试验用二个厂家的TAL对红花黄色素氯化钠注射液三批供试品溶液进行干扰试验,结果表明红花黄色素氯化钠注射液最大不干扰稀释倍数为16倍,其内毒素限值为:每 1 ml含内毒素量应小于0.5 EU/ml。试验中对我公司生产的90301019、90301028、90301031三批红花黄色素氯化钠注射液进行了细菌内毒素检查,结果符合规定。

综上所述,我们认为红花黄色素氯化钠注射液,可以采用细菌内毒素方法进行检查,若出现 3家鲎试剂结果的差异,可采用特殊鲎试剂进行进一步研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 2005版:一部[M].北京:化学工业出版社,2005:79,116.

[2] 李道明.注射用头孢孟多酯钠细菌内毒素检查法的建立[J].中国药事,2008,22(11):1002.

[3] 刘英华,王志良,葛慧卿,等.注射用阿奇霉素细菌内毒素检查方法的研究[J].中国药事,2007,21(9):752.

[4] 廖一静,麦曦,李蔚雯,等.葡萄糖酸依诺沙星注射液中细菌内毒素的检查[J].江西医学院学报,2007,47(5):33.

[5] 李霞.细菌内毒素检查法在药品申报资料中应注意的问题[J].中国药事,2007,21(6):401.