氢氧化铝佐剂对Nogo-66免疫原性的影响

岳红云, 贺翔鸽, 燕振国, 曹 虹, 马岩梅

(1兰州军区兰州总医院眼科, 兰州 730050; 2第三军医大学大坪医院眼科; *通讯作者,E-mail:Xiangge he@hotmail.com)

为了加强机体对一定免疫原的免疫应答,常应用各种免疫促进剂,称为免疫佐剂(immunological adjuvant,IA),佐剂与免疫原混合,可以加强对免疫原的免疫应答能力。佐剂增强对免疫原的免疫应答,但并不赋予半抗原免疫原性。

Nogo-66蛋白的等电点为6.09;当 pH＞pI的溶液中,蛋白质为阴离子,根据 Nogo-66蛋白的等电点,当 pH=7时,Nogo-66在电场中向阳极移动;而中性 pH值时,硫酸铝带负电荷,氢氧化铝带正电荷。因此,选择 Nogo-66蛋白的适合佐剂时,选择氢氧化铝为适合佐剂。

在已经证实 Nogo-66蛋白免疫原性[1]的基础上,本实验拟验证其生物效应及免疫反应过程的特征,试图了解氢氧化铝佐剂对Nogo-66蛋白免疫原性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄正常成年 SD大鼠 48只,体重 200-220 g,雌雄不拘,动物由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供,许可证号:SCXK(渝)2003.0003。

1.2 方法

1.2.1 氢氧化铝佐剂的Nogo-66蛋白吸附率计算

氢氧化铝佐剂与 Nogo-66蛋白吸附方法:取氢氧化佐剂混悬液 1 ml后,按照说明书,与 4%Nogo-66蛋白溶液以体积比例 1∶1,1∶2,1∶3配制,充分微量震荡混匀 30 min。

微板考马斯亮蓝蛋白定量法计算上清液中的Nogo-66蛋白质浓度:①500 r/min离心混合后的氢氧化铝佐剂与 Nogo-66蛋白质 1 min,取上清液,分别标记体积比例 1∶1,1∶2,1∶3为样本 1,2,3。 ②10 mg考马斯亮蓝 G-250溶于 5 ml 95%乙醇溶液,加入 85%磷酸 10 ml,混匀,取 1.5 ml母液,其余部分作为储存液保存于 4度冰箱。③于 1.5 ml母液中加入双蒸水8.5 ml,作为工作液,制作标准曲线。④样本 1,2,3中 Nogo-66蛋白质浓度测量。

氢氧化铝佐剂的Nogo-66蛋白吸附率计算:按照公式[1]:氢氧化铝佐剂的Nogo-66蛋白的吸附率=(原有蛋白质量-上清液中蛋白质的量)/原有蛋白质量×100%。样本 1,2,3中,Nogo-66蛋白的吸附率分别为20.57%,21.06%,20.88%。

1.2.2 吸附氢氧化铝佐剂的Nogo-66蛋白免疫大鼠 健康 8周龄 SD大鼠 40只,随机纳入蛋白质组与高剂量佐剂组、中剂量佐剂组及小剂量佐剂组各10只,各组动物均采用 1%异戊巴比妥钠 0.8 ml腹腔注射麻醉。所有实验动物于实验第1天开始免疫,接种频次 1次 /7 d,免疫 4次。

免疫注射液配制及注射方法:将冻干粉 Nogo-66蛋白用等渗 PBS稀释至 4 mg/ml,按照前述氢氧化铝佐剂与 Nogo-66蛋白吸附比例与方法配制注射液后,稀释 10倍,给予实验大鼠 1 ml背部及双后趾皮下多点注射。对照组实验动物以相同时间及频次给予 1 ml等渗 PBS背部及双后趾皮下多点注射对照。

1.2.3 流式细胞术检测处于活跃分裂期细胞数目

计算处于增殖期细胞的数量及占细胞总量的百分比,周期中 S及 G2/M期细胞百分比。于初次免疫后8 d,16 d不同时间段取各组 SD大鼠各 5只。同前方法麻醉大鼠,取出新鲜大鼠脾脏后,提取细胞,淋巴细胞分层液分离脾脏淋巴细胞。流式细胞检测仪进行检测。

2 结果

2.1 一般情况 实验动物共 40只,试验过程中,各组均无死亡大鼠。所有大鼠试验数据均符合统计学分析要求。

2.2 各实验组脾淋巴细胞增殖能力检测 蛋白质组、高剂量佐剂组、中剂量佐剂组及小剂量佐剂组的SD大鼠脾淋巴细胞经过流式细胞仪检测结果见表1,表2,图1。高剂量佐剂组的脾淋巴细胞增殖程度为最小,中剂量佐剂组与小剂量佐剂组无统计学差异,而与高剂量佐剂组有统计学差异。三组比单纯蛋白质组的免疫原性均较低,差异有统计学意义。

3 讨论

神经系统损伤后,局部级联反应的损伤抗原Nogo-66具有明确的免疫原性[1],通过免疫佐剂的吸附之后,能否得到更强免疫原性,从而对于神经免疫保护过程起到持久作用,是前期实验基础上所要完成的内容。

本试验中,应用不同吸附比例氢氧化铝悬液(alum precipitate,AP),对Nogo-66蛋白质进行处理,目的是促进抗原的吸收,并使抗原连续缓慢在受试动物机体释放,从而判断佐剂能否增强实验动物对M[TM]摄取和处理抗原的活性。应用在不同时间观察分相情况,并及时检查吸附度的方法,监测上清中抗原的量,除以制造时加入抗原的总量,计算吸附百分率。通过分析各时间段淋巴细胞增殖情况[2],判断 Nogo-66蛋白的免疫原性及其促进淋巴增殖的时间峰值。所得到的数据证实,佐剂存在的前提下,刺激 T淋巴细胞的免疫原性较单纯的Nogo-66蛋白降低[3]。

铝佐剂的作用机制主要表现在吸附率越高,佐剂效果越明显。很小剂量的铝可以使抗原完全吸附,但不能达到最好的佐剂效果。使用铝佐剂,除了100%吸附的剂量外,尚需附加量的铝佐剂[4]。其原因可能是免疫局部有足够量的铝佐剂,以确保逐步释放抗原[5]。佐剂本身可能刺激吞噬细胞活性,但是过多的佐剂抑制抗原释放。本实验中,氢氧化铝佐剂对Nogo-66的影响表现为对免疫原性的抑制作用,其原因可能在此。

表1 免疫后4 d SD大鼠脾脏 T淋巴细胞增殖结果Tab 1 Comparison of proliferation of T lymph cells in SD rats after immunization for 4 d among 4 groups

表2 SD大鼠脾脏T淋巴细胞增殖结果 (免疫后8d)Tab 2 Comparison of proliferation of T lymph cells in SD rat after immunization for 8 d among 4 groups

图1 免疫后4d淋巴细胞周期流式图Fig 1 The cell cycle of T lymph cells after immunization for 4 d by flow cytometry

Nogo-66蛋白在进入体内后,根据其抗原表位的特征,只有通过吞噬细胞的处理,才能够暴露抗原表位的小肽段,从而刺激 T淋巴细胞,激活后者的免疫作用[6]。但是由于铝佐剂对吞噬细胞有细胞毒作用,因此,可能导致对于蛋白的处理能力降低,表现抗原表位肽段表达程度降低后,细胞免疫功能下降[7]。

如果实验的目的在于制成人用疫苗,为了降低EAE发生可能性,最初的实验步骤中,并不苛求非常高的免疫原性[8]。重要点在于中枢神经系统能否达到如周围系统一样的免疫应答,激活相对免疫赦免系统的EAE之前,Nogo-66蛋白激活损伤抗原特异性 T淋巴细胞,完成损伤过程中被损害的免疫系统的修复。

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