奶牛隐性乳房炎诊断方法比较

高玉君 ，牛家华 ，梁海滨 ，张广庆 ，王玉才

（1.中国农业大学，北京 100094；2.泰安市畜牧兽医局，山东泰安 271000；3.岱岳区畜牧兽医局，山东泰安；4.新泰市羊流镇兽医站，山东新泰 271000）

奶牛乳腺炎是世界乳制品行业危害性很大的疾病，据报道，乳腺炎给奶牛业造成的危害包括：直接造成产奶量减少；由于牛奶变质和药物残留使其不能被食用；一些牛无法治愈被淘汰造成的损失；在治疗乳腺炎期间医疗费的开支；护理病牛所需的劳动力开支等[1]。世界上多数国家奶牛乳腺炎的发病率约为40%，每头牛产奶量平均减少约15%。在美国自20世纪90年代以来受此影响，每年经济损失达20亿美元，平均每头牛每年损失200美元左右[2-3]。我国每年因乳房炎损失也超过了3亿元。更为严重的是由于某些乳腺炎具有传染性，少数几头牛的感染就常可导致整个牛场乳腺炎的蔓延。

临床型乳房炎可产生明显的症状，如泌乳量下降，乳房肿胀，乳房的炎症变化等临床症状较易作出诊断。奶牛隐性乳房炎的诊断方法有多种：乳汁体细胞计数，CMT法，乳盘实验，NaGase法，氯化钙凝乳试验及改良法，乳房炎简易诊断液法，乳中细菌ATP含量测定法，兰州LMT隐乳试验，牛乳酶学试验，乳中乳酸脱氢酶、谷氨酸丙酮酸转氨酶、血清白蛋白含量测定，微生物学培养，SMT试剂诊断法，免疫学诊断等[4-8]。

本次试验通过对76头奶牛进行隐性乳房炎调查，结果发现37头患有隐性乳房炎，对其中17头奶牛68个乳区分别采用细菌学检测、CMT（California mastitis test）、BTB（Bromo—thymol blue test）、NFT（Negretti field test）、氯化物硝酸银试验等体细胞计数（Somatic cell count，SCC）方法对其进行比较性诊断，并作出评价，以探讨在泰安寻找一种比较准确可靠、经济实用的乳房炎诊断方法。

1 材料

1.1 被检奶牛

17头黑白花奶牛处于不同的泌乳期（4，3，2胎），平均年龄为 5.2周岁。卫生管理、营养状况一般，场内乳房炎、阴道炎、胎衣不下、子宫内膜炎较高，场内结核、副结核检疫阴性，对17头奶牛按照牛耳标号从小到大排列编成1~17号。

1.2 奶样的采集

采样前首先用清洁的湿毛巾擦净乳头，然后用千分之一的新洁尔灭消毒乳头。采样时先挤掉3~4把奶，再将20 mL乳样挤入已经高压灭菌的试管中，在试管上详细标记奶牛耳标号和乳区，送至实验室检验，时间间隔不超过24小时。

1.3 材料 尹红—美兰培养基、营养琼脂、高盐甘露醇琼脂、营养肉汤、微量发酵管、绵羊鲜血琼脂培养基、马铃薯培养基（将马铃薯去皮切成小块，取 200 g，玉米粒大小，1 000 mL水煮沸30 min，用双层纱布过滤得汁，加水补足1 000 min，加琼脂粉25 g，葡萄糖2 g，用80%的乳酸调pH值到6.0~8.0，经高压灭菌，冷却后，倾注平皿，冷藏保存）。

BTB试剂、NFT试剂、BMT诊断液、CMT试剂等。

2 方法

2.1 先进行细菌的分离和鉴定，取17头奶牛的乳样68个乳区乳样68份，每份 10 mL，2 000~3 000 r/min离心15 min，弃去管中的上层液体，留取底部沉淀物，无菌操作吸取0.1 mL乳样分别接种于绵羊鲜血琼脂培养基、尹红—美兰培养基、营养琼脂培养基、高盐甘露醇琼脂培养基[9-10]。

2.2 然后用各检测法进行对比

2.2.1 CMT试验 用于间接检测乳汁中体细胞总数。将等量的试剂与乳汁混合，10 s后根据判断标准观察结果。

2.2.2 NFT试验 用于间接检测乳汁中体细胞总数。将乳汁和试剂按比例混合，10 s后根据判定标准观察结果。

2.2.3 体细胞计数用于直接检测乳汁中体细胞数。将0.01 mL乳汁在载玻片中央涂布约1 cm，经干燥、脱脂、固定、染色、脱色后，干燥镜检。根据公式计算结果。以每毫升乳汁含有50万个细胞以上为隐性乳房炎阳性。

2.2.4 BTB试验用于间接检测乳汁中pH。将第一部分乳汁充分摇匀，吸取被检乳汁5 mL置洁净试管，再加1mLBTB试剂，摇匀静置10s后观察颜色反应，根据判断标准观察结果。

2.2.5 氯化物硝酸银试验 用于检测乳汁中氯化物的含量。试剂和乳汁按比例混合后，呈棕红色者为阴性乳；呈黄色者为阳性乳。

3 结果

3.1 细菌检测（见表1） 在68个乳区中的32个乳区共检测到43株细菌。其中链球菌9.30%（4/43）、大肠杆菌 30.23%（13/43）、葡萄球菌 30.23%（13/43）、棒状杆菌 11.63%（5/43）、沙门氏菌 4.65%（2/43）、枸橼酸杆菌4.65%（2/43）、酵母菌 9.30%（4/43）。

?

3.2 体细胞计数检测结果（见表2）用体细胞计数对68个乳区的乳样进行检测，乳房炎阳性乳区28个，阳性率为 41.18%（28/68），阴性乳区 40个，阴性率为 58.82%（40/68）。

3.3 CMT检测结果（见表2） 用CMT试剂对68个乳区的乳样进行检测，乳房炎阳性乳区28个（其中强阳性6个、阳性15个、弱阳性7个），阳性率为41.18%（28/68）；可疑乳区1个，可疑率1.47% ；阴性乳区39个，阴性率为57.35%（39/68）。

3.4 BTB检测结果（见表2） 用BTB试剂对68个乳区的乳样进行检测，乳房炎阳性乳区23个，阳性率为33.82%（23/68），可疑乳区 20个，可疑率为 29.41%（20/68）；阴性乳区 25个，阴性率为 36.76%（25/68）。

3.5 NFT检测结果（见表2） 用NFT试剂对68个乳区的乳样进行检测，乳房炎阳性乳区24个，阳性率为35.29%（24/68），可疑乳区 18个，可疑率为 26.47%（18/68），阴性乳区 26个，阴性率为 38.24%（26/68）。

?

3.6 氯化物硝酸银试验结果（见表2） 用氯化物硝酸银试剂对68个乳区的乳样进行检测，隐性乳房炎阳性乳区22个，阳性率为29.41%（20/68），可疑乳区25个，可疑率为36.76%（25/68）；阴性乳区 21个，阴性率为 30.88%（21/68）。

结果表明：体细胞计数、CMT、BTB、NFT、氯化物硝酸银的乳区阳性符合率分别为100.00%、100.00%、82.14%、85.71%、78.57%。

4 讨论

4.1 对泰安市奶牛场牛群中17头患有隐性乳房炎临床症状的奶牛进行检测，结果在32个乳区检测到43株病原菌；对68个乳区的乳汁用各种诊断方法检测，对不同方法的检测结果进行比较发现体细胞计数法、CMT和细菌学检查据有高度的一致性，监测到28个乳区存有隐性乳房炎。

4.2 CMT试验是美国加利福尼亚州乳腺试验，其基本原理是阴离子表面活性剂一烷基或烃基硫酸盐，破坏乳中的体细胞，释放其中的核酸，核酸与试剂结合产生沉淀或凝胶。细胞中聚合的脱氧核糖核酸（DNA）是CMT产生反应的主要成分，乳中体细胞越多，释放的DNA越多，产生的沉淀或凝胶也就越多。国内许多研究机构根据相似原理研制出各种隐性乳房炎检测试剂，如 LMT、BMT、HMT等，达到了CMT的国产化。根据试验结果，CMT对奶牛隐性乳房炎检测效果较好，具有操作简便、敏感可靠、价廉等特点，特别适用于大型奶牛场的现场快速诊断。

4.3 体细胞计数是指每毫升乳汁中含有的体细胞数量。体细胞包括多种类型的细胞：中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、酸性粒细胞及各种乳腺上皮细胞。乳汁体细胞计数是一种可靠、传统监测奶牛隐性乳房炎的方法，可确定乳汁中体细胞数范围，较精确的判断隐性乳房炎的炎症程度，对乳房炎的诊断具有重要意义。但步骤较繁琐，耗时较长，只适用于实验室诊断，在临床检测中受到限制。

4.4 BTB、NFT和氯化物硝酸银试验虽然较为方便，但由于检出率低，特别对泌乳末期的奶牛检测可出现假阳性，因而各检测方法不宜单独使用。此外，BTB和氯化物硝酸银试验中对颜色的判断可出现较大的误差，易误判。

4.5 本次试验病原菌的检出率与乳房炎检出阳性率具有较高的符合率，达100%。但在正常乳汁中也检测到了细菌的存在，可见细菌的分离鉴定并不是一种很好的诊断方法。因此，对奶牛场乳房炎进行细菌学调查有助于了解菌群的分布，对更好的防治奶牛乳房炎，进一步提高牛奶的产量和质量具有重要意义，对于临床诊断意义较小。

4.6 目前，随着分子生物学技术的发展，PCR技术在检测致病菌方面得以广泛应用，国内外多有报道利用PCR技术检测奶牛乳房炎，快速鉴定病原菌，但一般奶牛场很难有力量购买此类仪器。也有养殖场使用有计步器来监测奶牛乳房炎等疾病发生情况，泰安鲁宝养殖有限公司采用以色列的先进养殖技术、牧场管理系统、挤奶设备、TMR奶牛全价日粮搅拌车、牛只自动称重设备和牛只计步器，来详细统计每头奶牛每天的活动量和采食量等情况，再通过乳汁、饲料、饮水等指标，通过数据分析、对比，测定每头奶牛是否患有乳房炎、踢叶炎、发情等情况，该方法测算准确，对大型奶牛场管理很有帮助。但投资大，一般奶牛场很难达到。

综上所述，我们认为CMT和体细胞计数是检测隐性乳房炎较好方法，其中CMT最简单快捷、经济实用，BTB、NFT、氯化物硝酸银和细菌学检测可辅助其他方法进行诊断。有条件的奶牛场可使用PCR技术或计步器等技术[11-12]。

[1]William C，Rebhum D V M.奶牛疾病学[M].赵德明，沈建忠，译.北京:中国农业大学出版社，1999.

[2]Charls N，Dobbins J R.Mastitis losses[J].J Am Vet Med Assoc，1997， 170:1129-1132.

[3]Ose A，Aldo C A，Horaco R，et al.Field trials of a vaccine against bovine mastitis 1:evaluation in heifers [J].J Dairy Sci，1997，80:845-853.

[4]蒋春茂，周新民，周广生，等.奶牛乳房炎研究进展 [J].中国畜牧兽医，2004，31（5）:36-38.

[5]杨慧萍，张周，肖乃志.奶牛隐形乳房炎研究进展 [J].黄牛杂志，2005，31（2）:54-57.

[6]苑方重，张继东，钟秀会，等.奶牛乳房炎研究现状 [J].动物医学进展，2003，24（4）:44-54.

[7]Nauriyal DS，Pachauri SP.Determination of milk enzyme NAGase activity for screening dairy herds for mastitis[J].Indian Journalof animalscience，1999，69（3）:175.

[8]Kitchen B J，Middleton G.Enzymatic methods for estimation of the somatic cell count in bovine milk[J].Journal of Dairy Research，1999，43:491-494.

[9]胡松华，杜爱芳，蔡渭明.奶牛临床型和隐性乳房炎的细菌分析[J].中国家畜传染病，1998，20（4）:199-201.

[10]张信军，李玉军，庄国宏，等.某奶牛场临床型乳房炎的病原分离及鉴定[J].畜牧与兽医，2000，32（5）:11-13.

[11]蒋春茂，周新民，周广生，等.奶牛乳房炎研究进展 [J].中国畜牧兽医，2004，31（5）:36-38.

[12]高树新，许尚忠，李金泉，等.奶牛乳房炎研究进展[J].中国草食动物，2004，24（5）:46-49.