PCR方法特异性鉴定狮源性制品

徐君怡，曹际娟，于 珂，徐 杨

（辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连 116015)

地球上目前存在的食肉动物大概有11个科，而最有特点并最重要的就是猫科动物。狮，俗称狮子，就是一种生存在非洲和亚洲的大型猫科动物。狮属于哺乳纲（Mammalia），食肉目（Carnivora），猫科（Felidae），豹属（Panthera），狮种（P.leo）。狮种中约有13~14个亚种，其中，欧洲狮、巴巴里狮、斑点狮、开普狮、喀啦哈里狮等五个亚种已经在地球上绝迹，剩下的大部份亚种都生活在萨哈拉沙漠南的非洲[1]。

为了野生动物贸易能够持续发展，各国制定了相应的野生动物保护法规，禁止濒危动物的捕杀和贸易。对一些受到绝灭威胁的物种限制其贸易量，以防止因狩猎和贸易对野生动物生存和持续利用造成威胁。国际上于1975年签署了《濒危野生动植物种国际贸易公约（CITES）》，我国于1981年加入该公约。尽管公约的成员国已达160个，野生动物非法狩猎和野生动物走私活动在世界各地仍非常猖獗，继续威胁着野生动物的生存。一些对狮虎豹皮和器官或制品有传统需求的民族通过新近的发展获得了新的经济水平，使得他们有足够的财力来获得挚爱的皮革、器官及其制品，这种需求极大地刺激了猫科动物的非法贸易，而国际间监管、执法艰难让保护力量显得过于苍白。

在野生动物取证过程中，有些情况下其产品经加工处理后失去了可辨认的形态特征，使狮产品的鉴定工作十分困难。为了更有效地加强狮的保护工作，建立一种可以对狮DNA进行特异性检测的准确性高、实用性强的方法，从分子水平对可疑来自于狮的样品（例如食品、药品、皮毛等）进行特异性检测鉴定，都是十分急需和必要的。有关狮DNA的特异性检测研究，在国外仅见于Wetton等对猫科动物骨DNA进行特异性检测的相关报道。国内对于该领域的研究几乎未见报道。本研究通过筛选狮与其它动物在线粒体细胞色素b（Cyt b）基因片段的碱基差异合成特异引物，经过PCR扩增和凝胶电泳，达到了特异性检测鉴定狮DNA的目的，并由此建立了一种灵敏、特异、简便、快速、稳定性好的狮DNA检测方法。

1 研究方法

1.1 样品种类及来源

本研究所用动物源性实验样品及其来源见表1，其中狮、虎、豹、熊等珍贵动物血液、毛发标本由大连森林动物园动物饲养研究保护基地提供，亚洲狮肉为因病死亡动物标本，经辽宁省林业局批准由大连森林动物园动物饲养研究保护基地提供。为确保样品来源明确可靠，所采集的各种动物的毛发样品均直接取自于动物体表或单独饲养的笼舍。

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1.2 仪器

高速离心机 5804（Eppendorf，德国），普通 PCR 仪，（PE24000，美国），核酸蛋白分析仪（Beckman DU640），恒温干燥箱（SANYO mov-213F，日本）。

1.3 引物合成

根据狮与其它多种猫科动物和哺乳动物mtDNA细胞色素 b基因序列的差异，及引物设计有关原则[2-4]，设计合成引物。引物序列由宝生物工程（大连）有限公司合成。引物序列为F:5'-CAAACCTGAATGGTACTTCCTA-3'，R:5'-AGATGGGTATTAGGATTA GAAGA-3'。

1.4 样品制备

称约100 g狮的肌肉组织，切碎，于120℃烘烤过夜，用组织研磨器研磨成粉末状。将狮肉粉和牛肉骨粉样品进行混合以得到系列百分比（100%，10%，1%，0.5%，0.1%）的狮肉粉和牛肉骨粉混合物。

1.5 模板DNA制备

提取血液类试验样品基因组DNA用的Blood Genome DNA Extraction Kit试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司，货号D9081。其它组织类和骨粉类样品采用动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司，货号DP323-03。从动物毛中提取总DNA主要参照公安部物证鉴定中心人的毛发提取方法进行[5]。

1.6 PCR扩增条件

反应采用25μL体系，按下列组分配置PCR反应液：10×PCR缓冲液2μL、引物（10μmol/L）各1μL、dNTP（10 mmol/L）2μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2μL、模板 DNA 1μL，加dH2O补足25μL。反应条件如下：94℃ 3 min；94℃ 1 min，66℃1 min，72 ℃1 min，35 个循环；72 ℃ 7 min结束反应；4℃保存反应产物。

1.7 PCR检测的特异性分析

以表1中所列各物种的基因组DNA为模板，按照1.6 PCR扩增条件进行狮源性制品的PCR检测鉴定特异性试验。

1.8 PCR检测的灵敏度分析

将1.4中制备的狮肉粉和牛肉骨粉系列百分比（100%，10%，1%，0.5%，0.1%）混合物，按照1.5模板DNA制备中的骨粉DNA提取方法进行混合物基因组DNA的提取。系列混合物DNA用于检测灵敏度分析。

2 结果

2.1 肌肉和血液样品中PCR检测特异性试验

取表1中所列的17种血液、组织和骨粉类样品的DNA进行PCR检测。狮种特异性检测结果的PCR产物电泳图谱如图1所示。试验结果显示，狮种中亚洲狮亚种的血液、肌肉组织和毛发DNA样本，东非狮亚种的血液DNA样本经过PCR扩增，得到阳性扩增产物。而虎、豹、熊的6种血液DNA样本，牛、羊、马、猪、狗、兔、驴、鹿等8种哺乳动物骨粉DNA样本以及空白水对照的检测结果均为阴性。上述结果表明：试验所设计引物为狮DNA的特异性扩增引物，而且对来自于不同个体和不同组织的DNA具有同样的扩增效果。

2.2 毛干中PCR检测特异性试验

对亚洲狮、东北虎、金钱豹、波斯猫脱落毛发进行DNA提取和扩增。图2显示仅亚洲狮样本出现特异性的扩增条带，而东北虎、金钱豹和波斯猫的毛发检测结果均为阴性。上述结果可证明引物仅对狮特异。

2.3 灵敏度试验

将1.4中制备的狮肉粉和牛肉骨粉系列百分比（100%，10%，1%，0.5%，0.1%）混合物，按照1.5模板DNA制备中的骨粉DNA提取方法进行混合物基因组DNA的提取。该系列的混合物DNA用于进行检测灵敏度分析。按照1.6 PCR扩增条件进行试验。结果显示，使用1.6中的扩增条件，可在含量为100%狮肉粉、10%狮肉粉、1%狮肉粉、0.5%狮肉粉中扩增出特异性的PCR扩增条带（图3）。表明本试验设计的特异性PCR引物可检出骨粉中0.5%的狮源成分。

3 讨论

检测鉴定狮属制品可靠的反应体系建立在合适的基因片段选择上，所选的基因必需种属特异性强，而在物种内变异性要小。为了选择一个合适的鉴定狮的基因片段，我们使用了欧洲分子生物学实验室的数据库（gene databanks，EMBL），比较其中足够多的种间数据。在一些侯选基因片段中，选择了线粒体细胞色素b（Cyt b）基因片段。在互联网上数据比对的结果表明，这段基因序列有足够的特异性可以满足设计种属特异性的引物对。线粒体细胞色素b（Cyt b）基因片段在脊椎动物中有很高的变异性。这里我们所设计的用来定性检测狮源物质的引物，在狮血、狮肉、狮毛样品中均可以出现特异性PCR扩增条带，而且对来自于不同个体和不同组织的DNA具有同样的扩增效果。其他14种非狮源样品（虎、豹、熊、牛、羊、马、猪、狗、兔、驴、鹿）PCR反应中没有出现扩增条带。

本研究所建立的对狮DNA进行特异性检测方法，是国内少数正在进行的狮 DNA检测方法的研究，除具有高特异性、灵敏性外，因其具有简便易行、快速、成本低等的特点而更具有实用性。此方法为海关、动植物检疫以及动物保护组织提供了快速检测鉴定狮制品的有效方法。

[1]Bauer H，Nowell K，Packer C.Panthera leo[M].3rd ed.UK:IUCN Red List of Threatened Species,2008.

[2]Driscoll C A，Menotti-Raymond M，Nelson G，et al.Genomic microsatellites as evolutionary chronometers:a test in wild cats[J].Genome Res，2002，12:414–423.

[3]Burger J，Rosendahl W，Loreille O，et al.Molecular phylogeny of the extinct cave lion Panthera leo spelaea[J].Mol Phylogenet Evol，2004，30:841–849.

[4]Dubach J，Patterson B，Briggs M，et al.Molecular genetic variation across the southern and eastern geographic ranges of the African lion Panthera leo[J].Cons Genet，2005，6（1）:15–24.

[5]郑秀芬.法医DNA分析 [M]．北京:中国人民公安大学出版社，2002:53．