不同频率冲击波促进兔管状骨成骨的实验研究

张继英 侯宇 薛涛 段小宁 傅欣 田明 于长隆

北京大学第三医院运动医学研究所（北京100191）

冲击波是机械波以超音速传播时，引起递质急剧强烈压缩的过程，可以使递质正相压力在极短的时间内从环境压上升至最大压力，再迅速下降[1]。体外冲击波疗法（extracorporeal shock wave therapy，ESWT）是利用能量转换和传递原理，造成不同密度组织之间产生能量梯度差及扭拉力，并形成空化效应，产生生物学效应。该疗法已广泛应用于治疗疲劳性骨折[2，3]、骨不愈合[4-6]，效果肯定。但冲击波促进成骨的变化过程，不同频率冲击波对管状骨骨膜、骨皮质作用仍未见报道。本研究以新西兰大白兔为研究对象，对兔胫骨中段外侧施以不同频率的冲击波处理，观察不同频率的冲击波对正常骨膜及骨皮质的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及冲击波治疗仪:39只（78例后肢）健康雄性新西兰大白兔由北京大学医学部实验动物中心提供。4月龄，体重2.15～2.5kg，在普通级条件下饲养。3只为正常对照组，36只为实验组。冲击波治疗仪（shock wave therapy instrument） 生产厂家为 ElectroMedical System—SWISS DOLORCLAST。

1.2 冲击波处理:实验组36只大白兔，随机平均分为3组，每组12只。氯胺酮1ml肌注麻醉，其中一组后肢胫骨中段外侧给予4Hz冲击波处理，共2000次；另一组后肢相同部位给予7Hz冲击波处理，共2000次；最后一组后肢相同部位给予15Hz冲击波处理，共2000次。术后普通饮食，自由活动。

1.3 取材与标本处理:冲击波处理后3天每组处死6只，7天处死剩余6只，对照组选取1只3天处死，7天处死剩余2只。取双侧胫骨中上1/3部分，生理盐水冲洗后，4%多聚甲醛固定，甲醛－甲酸脱钙，脱钙完全后，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5μm，50℃蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50℃烘箱内烤片备用。

1.4 苏木精－伊红染色:组织切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化到自来水，蒸馏水冲洗；苏木精染色2min，分化，返蓝，自来水冲洗；蒸馏水冲洗后伊红染色1min，自来水冲洗；脱水上行至二甲苯，中性树胶封片。

1.5 甲苯胺蓝染色:组织切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化到自来水，蒸馏水冲洗；0.5%甲苯胺蓝染色5min，自来水冲洗；脱水上行至二甲苯，中性树胶封片。

1.6 主要观察指标

1.6.1 组织学变化:通过HE染色和甲苯胺蓝染色观察骨膜和骨皮质的组织学变化。

1.6.2 骨膜生发层细胞计数:切片HE染色后，在200倍光镜（OLYMPUS BX51 Japan）下选取骨膜生发层细胞最多的视野6张，计数6个视野内骨膜生发层细胞与正常骨膜生发层细胞相比增加的百分数。

1.6.3 骨膜生发层厚度测量:切片HE染色后，在200倍光镜（OLYMPUS BX51 Japan）下随机选取自外骨膜纤维层至骨皮质的视野6张，Micro-Image v4.5 imaging software计数6个视野内骨膜生发层厚度。

1.6.4 髓腔开放程度测量:切片HE染色后，在200倍光镜（OLYMPUS BX51 Japan）下随机选取骨皮质紧贴外骨膜生发层的视野6张，MicroImage v4.5 imaging software计数6个视野内非骨组织面积百分比。

1.7 统计学分析:各组数值采用均数±标准差表示，数据采用SPSS10.0软件包进行统计分析，两组比较采用秩和检验，P<0.01为具有显著性差别。

2 结果

2.1 骨膜和骨皮质组织学变化（图1、2）

2.1.1 冲击波处理后3天

对照组:骨膜组织未见出血，外骨膜生发层薄，外骨膜纤维层纤维组织密集排列；可见骨皮质，骨髓腔未见开放，内骨膜未见明显变化，骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色。

4Hz、7Hz实验组:骨膜组织有大量出血，可见骨膜生发层及纤维层均有红细胞出现，外骨膜生发层增厚，细胞数量多，细胞核呈圆形者居多，外骨膜纤维层纤维组织密集排列；可见骨皮质增厚，骨髓腔开放，髓腔内细胞增生，外骨膜向内长入，与髓腔相通，内骨膜未见明显变化，骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色。

15Hz实验组:骨膜组织有出血，可见骨膜生发层及纤维层有少量红细胞出现，外骨膜生发层增厚，细胞数量多，细胞核呈圆形者居多，外骨膜纤维层纤维组织密集排列，骨髓腔未见开放，髓腔内细胞增生，内骨膜未见明显变化，骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色。

2.1.2 冲击波处理后7天

对照组:骨膜组织未见出血，外骨膜生发层薄，外骨膜纤维层纤维组织密集排列；可见骨皮质，骨髓腔未见开放，内骨膜未见明显变化，骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色。

4Hz处理组:骨膜组织仍有少量出血，可见红细胞；骨膜生发层增厚，细胞数量多，细胞核呈圆形者居多，骨膜纤维层纤维组织疏松排列，外骨膜与髓腔相通，髓腔内细胞增生，内骨膜仍未见变化，骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色。

7Hz处理组:骨膜组织出血基本消失，红细胞少；骨膜生发层增厚，细胞数量多，细胞核呈圆形者居多，骨膜纤维层纤维组织疏松排列，外骨膜与髓腔相通，髓腔开放程度远高于15Hz组，但与4Hz组无明显差异，髓腔内细胞增生，内骨膜仍未见变化，骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色。

15Hz处理组:骨膜组织仍有出血，可见红细胞；骨膜生发层增厚，细胞数量多，细胞核呈圆形者居多，骨膜纤维层纤维组织疏松排列，外骨膜与髓腔未见相通，内骨膜仍未见变化，骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色。

2.2 骨膜生发层细胞计数（图3）

冲击波处理3天后，骨膜生发层细胞明显增多，对照组 :100.3±5.8% ；4Hz 组 :251.3±11.5% ；7Hz 组 :272±13.2%；15Hz组:256±8.2%。冲击波处理后7天，生发层细胞比处理后3天显著增多，但密度下降。对照组:101.2±6.3%；4Hz 组:601.3±11.5%；7Hz 组 :602±83.2%，15Hz组:510±73.2%。4Hz、7Hz实验组细胞数量显著多于15Hz实验组与对照组。

2.3 骨膜生发层厚度（图4）

冲击波处理3天后，骨膜生发层增厚，4Hz组:8.2±1.3μm；7Hz组:8.0±1.1μm；15Hz组:8.2±0.97μm。冲击波处理7天后，骨膜生发层显著增厚，4Hz组:20.4±1.3μm；7Hz组:34.5±3.2μm；15Hz组:14.1±3.6μm。

冲击波处理3天，不同实验组骨膜生发层厚度无显著差异；冲击波处理7天，4Hz、15Hz组骨膜生发层厚度显著低于7Hz组。

冲击波处理3天后，髓腔均有开放，4Hz组:37%±13.6%；7Hz:45±11.6%，15Hz:33±9.6%；冲击波处理 7天后，4Hz组:55%±12.3%；7Hz组:92±10.6%，15Hz组:46±12.2%；冲击波处理后，7Hz组髓腔开放程度显著高于4Hz组和15Hz组。

3 讨论

体外冲击波被广泛应用于骨延迟愈合与骨不愈合[7，8]。本实验结果表明，冲击波促进骨膜生发层增生，骨皮质增厚，髓腔开放，外骨膜与髓腔相通，而内骨膜无明显变化；4Hz和7Hz实验组骨膜生发层细胞数量、髓腔开放程度均高于15Hz实验组；15Hz冲击波处理后3天髓腔轻度开放，处理后7天髓腔开放程度降低。

本研究观察到，正常胫骨中段经过不同频率冲击波冲击后均有外骨膜出血增厚，骨髓腔开放并纤维化，可以见到成骨样细胞增生，出现典型的骨膜成骨改变，说明骨膜组织增生成骨主要依靠:（1）外骨膜生发层成骨样细胞增生；（2）骨皮质增厚，髓腔内成骨样细胞增生，髓腔开放；（3）外骨膜生发层与髓腔相通，骨髓纤维化，髓腔内增生组织与外骨膜生发层组织融合。骨折延迟愈合，肥大性骨折不愈合，较小的骨缺损，存在较多的骨膜组织，冲击波治疗可以促进外骨膜生发层与髓腔内成骨样细胞增生，填充缺损，促进愈合；对于较大的骨缺损，冲击波治疗虽然可以促进成骨样细胞增生，但是并不足以填充缺损；对于萎缩型骨折不愈合，冲击波治疗可能无法促进髓腔内增生组织与外骨膜生发层组织融合，因此单纯冲击波治疗疗效不佳，目前多采用手术结合冲击波治疗[9]。

本研究结果显示，冲击波处理7天组骨髓腔开放及纤维化程度改变要比3天组更为明显。Montero等[10]研究发现500次及以上的冲击波可以造成外骨膜分离，骨皮质微骨折，低于500次的冲击波未见到变化。这说明冲击波促进成骨存在剂量效应，在使用过程中需选择合适的剂量。

本研究中，正常胫骨中段经过不同频率冲击波冲击后出现典型的骨膜成骨的改变，所有实验组骨膜及骨皮质均未见甲苯胺蓝阳性染色，未见软骨形成。骨折愈合过程中有两种成骨方式，即膜内化骨及软骨内化骨。由骨膜增生、钙化成骨的过程称为膜内化骨。骨折断端及髓腔内的血肿形成血凝块，历经肉芽组织、纤维组织、软骨组织，最终转变为骨组织，称为软骨内化骨。本研究中所有实验组未见软骨形成，说明冲击波是通过外骨膜膜内化骨促进成骨，不经过软骨化骨的过程。外骨膜由纤维的膜性结构和含有成骨细胞的生发层组成。本研究结果表明适当频率的冲击波促进外骨膜生发层细胞增生，增强了外骨膜的成骨作用；对应部位骨髓腔开放，髓腔纤维化，向成骨方向发展，应该是外骨膜成骨诱导作用的表现；外骨膜纤维层作为一种特殊的膜，能够阻挡成纤维细胞进入到骨膜生发层，使骨质形成免受周围软组织侵犯，为目的细胞的进入、增殖创造良好的条件，具有引导和限制组织再生的作用。本研究中各实验组均可见到外骨膜纤维层纤维组织密集排列，形态完整，说明冲击波未破坏外骨膜纤维层，未影响诱导作用。冲击波增强了外骨膜的成骨及诱导成骨的双重作用，

本研究结果显示，冲击波可造成外骨膜组织与髓腔内成骨样细胞增生，而内骨膜无明显变化。Montero等[10]研究发现500次及以上的冲击波可以造成外骨膜分离，骨皮质微骨折，但没有观察到明显的骨折线，但是本实验未观察到外骨膜分离，骨皮质微骨折的现象。王五洲等[11]对新西兰种兔肢体实施体外冲击波治疗，取骨膜组织进行体外培养和3H-TdR渗入放射自显影研究。结果表明，冲击波治疗后1～2周，实验侧骨膜组织3H-TdR标记率为对照侧的2倍，表明冲击波加速了DNA的复制，促进了骨膜成骨细胞的增殖，因而骨膜成骨作用加强，加速创伤后骨折愈合，与本实验结果一致。冲击波促进外骨膜与髓腔内成骨样细胞增生的原因可能是:（1）通过应力效应造成骨膜的微损伤，冲击波引起组织细胞的拉伸，组织间松解，细胞的弹性变形，活化了细胞，激活细胞的增殖，促进骨痂生成，实现骨愈合；（2）冲击波的脉冲尾部的负向波段压可引起空化效应（Cavitation）[12]。当流体动力场所受的压力低于液体的饱和汽压时，液体中的分子就会进入空化反应核（微小气泡），并使其膨胀，变成可以观测到的大小，这就是空化效应。空化效应可对细胞产生刺激，改善微循环。本实验未观察到内骨膜明显变化，可能有两个原因:（1）应用冲击波治疗时，冲击波在由软组织传入骨组织时，会产生反射和折射，对骨膜组织及周围组织产生较大的影响[2，13]；（2）冲击波前沿的尖峰部分主要由高频波组成，其余部分则由低频波组成。高频波的聚焦性能较强，焦点的能量密度高，但对组织的穿透能力差；而低频波对组织的穿透能力较强，但聚焦性能差，焦点的能量密度低[12]。冲击波经过外骨膜、骨皮质，抵达内骨膜时，高频波能量大幅衰减，对内骨膜影响低；而低频波穿透能力强，能量密度低，对内骨膜作用小[14]。Kojimoto等[15]行兔胫骨截骨后骨痂延长术，通过X线片及组织学检查，发现去除外骨膜后骨痂形成明显受到干扰，骨质无法延长；与之相反，去除内骨膜后，对骨及骨痂形成并没有明显影响。这说明骨外膜对骨折愈合的影响大于骨内膜，在骨折愈合过程中起到主要作用。

本研究结果表明，不同频率冲击波促进管状骨成骨的能力不同。4Hz、7Hz实验组骨膜生发层细胞数量、髓腔开放程度均高于15Hz实验组，这可能是由于高频率冲击波能量主要分布于外骨膜，对骨皮质及髓腔影响不足，且空化效应较强，造成损伤过度。所以在应用冲击波治疗时需选用恰当的频率。

本实验创新点在于:（1）观察了冲击波促进成骨的早期病理变化过程，发现冲击波促进外骨膜生发层组织增生、髓腔开放、骨髓纤维化，髓腔内增生组织与外骨膜增生组织融合，而未见软骨形成；（2）发现不同频率的冲击波作用不同，较低频率冲击波（7Hz，4Hz）对管状骨骨膜及骨皮质影响大于较高频率冲击波（15Hz），提示应用冲击波治疗时需选用恰当的频率。

需要指出，本实验不是研究冲击波对骨的延迟愈合或不愈合的作用，其结论不一定适用于冲击波对骨不愈合或延迟愈合的治疗。在病理条件下外骨膜与骨皮质反应可能有不同。此外，本研究也仅观察了冲击波处理早期骨膜及骨皮质的病理变化。

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