中等强度跑台运动和雌激素对去卵巢大鼠肝脏NO含量及eNOS和iNOS表达的影响

卜淑敏 王怡婧 张焱

首都体育学院（北京 100088）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种重要的信使分子，在循环、呼吸、消化及内分泌等系统中发挥重要调节作用[1]。妇女绝经后因卵巢功能衰退，雌激素（estrogen，E2）分泌减少，易患绝经综合症[2]。研究表明，无论是绝经后的妇女还是去卵巢后的大鼠，其血清NO水平均显著下降，而雌激素替代疗法和中等强度运动均能通过增加血清和/或组织NO水平而对绝经后妇女和去卵巢大鼠的心血管实施保护作用[3-6]。由于血清中生理剂量的NO主要来源于血管内皮细胞和肝细胞[7]，本实验采用目前国内外普遍使用的模拟女性绝经综合症及其相关疾病的去卵巢大鼠模型[8]，观察中等强度跑台运动和E2对去卵巢大鼠肝组织匀浆NO含量及肝组织eNOS和iNOS蛋白表达的影响，为深入探讨运动和E2改善绝经综合症的机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

17β-estrodial（E2）:Sigma公司；速眠新注射液（麻醉剂）:中国人民解放军农牧大学军事兽医所研究产品；一氧化氮试剂盒:南京建成生物工程有限公司。Rabbit-anti-NOS2（N-20，sc-651）和 Rabbit-anti-NOS3（C-20，sc-654）:Santa Cruz Biotechnology；辣根酶标记链酶卵白素、山羊抗兔IgG/生物素标记和DAB显色试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司；DSPT-202小动物跑台:杭州段氏制造厂生产；721分光光度计:上海光华仪器厂；LG10-3A离心机:北京离心机厂。

1.2 实验动物手术和分组

健康3月龄雌性SD大鼠60只，体重（230±15）g。购自并在北京维通利华实验动物有限公司饲养[合格证号:SCKK（京）2006-0008]。适应饲养1周后，按体重随机分为假手术组（20只）和手术组（40只）。两组大鼠均禁食12h，腹腔注射速眠新（0.7ml/kg）麻醉，手术组从背部切除双侧卵巢，假手术组不切除卵巢，而将卵巢旁与卵巢等大的脂肪组织切除。1周后按体重将手术组大鼠又随机分为去卵巢静止组、去卵巢运动组、去卵巢加雌激素（E2）组和去卵巢运动加雌激素（去卵巢运动加E2）4个组，同时将假手术组又分为假手术静止组和假手术运动组2个组。各组大鼠同等条件饲养，在实验过程中，有5只大鼠先后在后续处理过程中死亡，最后纳入实验的各组大鼠的数目分别为:假手术组9只、假手术运动组10只、去卵巢组 9只、去卵巢运动组10只、去卵巢加 E2组8只、去卵巢运动加E2组9只。

1.3 运动训练和E2注射方案

跑台运动训练和E2注射方案均参考相关文献报道并进行适当调整[9]。手术后第2周，各运动组大鼠在小动物跑台上开始适应训练1周，时间从第1天的15min逐渐增加到第5天的60min。正式运动训练期为12周，每周5次，每次 60min，速度 18m/min，坡度为 0。去卵巢加E2组和去卵巢运动加E2组大鼠每周颈部皮下注射3次E2，每次注射剂量为50μg/kg体重。运动训练和药物处理均在每天上午固定时间进行，每周称量大鼠体重一次，根据体重调整E2的注射剂量。

1.4 取材

末次运动与药物处理24小时后，用速眠新麻醉，腹主动脉取血后断头处死，处死前断食12小时。迅速取大鼠肝脏置于预冷的生理盐水中洗净血污，切取相同部位2mm×2mm×2mm的组织块立即置于预先备好的4%的多聚甲醛溶液中固定以备免疫组化检测；其余组织用滤纸吸干后置于－80℃冰箱保存备用。

1.5 肝脏匀浆液NO的测定

称取100mg肝脏，加1ml 0.86%的生理盐水，在玻璃匀浆器中匀浆制成10%匀浆液。采用亚硝酸还原酶法测定肝脏匀浆液中的NO含量，所有操作均依照试剂盒说明书的步骤进行。

1.6 免疫组化检测

将石蜡包埋的组织切成5μm厚的切片，二甲苯及梯度乙醇脱腊复水。10%羊血清37℃封闭1h后，加入抗人NOS2和NOS3一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次。加入生物素标记的羊抗兔二抗，37℃孵育 30min，1×PBS洗 3次。加入辣根酶标记的链亲合素，37℃孵育30min，PBS洗3次。DAB试剂盒室温显色10～20min后，苏木素复染1min，用梯度乙醇和二甲苯脱水，中性树胶封片后，Olympus显微镜下观察及拍照。

1.7 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件处理数据，实验结果以平均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（F检验），若方差齐性，则采用t检验，若非齐性，采用t'检验，P<0.05被认为差异有显著性。

2 结果

2.1 肝组织匀浆NO含量

表2显示，与假手术组相比，假手术运动组肝组织匀浆NO含量显著升高（P<0.05），去卵巢组肝组织匀浆NO含量显著降低（P<0.05）；与去卵巢组相比，去卵巢运动组（P<0.05）、去卵巢加 E2组（P<0.05）和去卵巢运动加E2组（P<0.01）肝组织匀浆NO含量显著升高，且去卵巢运动加E2组显著高于去卵巢运动组和去卵巢加E2组。

表1 各组肝组织匀浆NO含量的比较Table 1 Comparison of the nitric oxide content of liver in all groups

2.2 肝脏eNOS蛋白表达

如图1所示，eNOS主要定位在肝窦内皮细胞及其周围肝细胞胞浆中，其中，去卵巢运动组（图1C）表达最低，去卵巢运动加E2组（图1F）表达最高。从图1可知，肝脏eNOS蛋白表达的变化趋势与肝匀浆NO含量变化趋势 基本相同。

2.3 肝脏iNOS蛋白表达

如图2所示，在假手术组（图 2A1、A2）、假手术运动组（图 2B1、B2）、去卵巢加 E2组（图 2E1、E2）和去卵巢运动加E2组（图2F1、F2）中，iNOS主要在肝细胞胞质中表达；在去卵巢组（图 2C1、C2）和去卵巢运动组（图 2D1、D2）中，iNOS既在胞质中表达，又在胞核中表达。从图2A1、B1、C1、D1、E1、F1 可知，肝脏 iNOS 蛋白表达变化不明显。

3 讨论

围绝经期妇女由于卵巢功能的逐渐衰竭都患有程度不等的绝经综合症，给其生活和工作带来诸多不便。雌激素替代和运动疗法均能改善绝经妇女的绝经综合症症状，但目前对其作用机制还不十分清楚[2]。NO是一种广泛存在的无机自由基，它既可以作为第一信使，又可以作为第二信使，还可以作为逆信使，在体内发挥重要的细胞信号传递效应[1]。Zaros等人报道[3]，为期 6 个月的体育锻炼能显著增加患有高血压的绝经后妇女血清NO含量；同样，Bednarek-Tupikowska等人的研究结果表明[4]，绝经后妇女血清NO含量显著低于未绝经妇女，而经4个月的E2治疗后，绝经后妇女血清NO含量显著增加。去卵巢动物是目前国内外通用的模拟E2缺乏的理想动物模型[8]。Grundt等人报道[5]，大鼠去卵巢后，血清、尿和动脉中的NO水平均显著下降，而给去卵巢大鼠补充生理剂量的E2（按照大鼠动情周期中E2的周期性波动规律补充外源性E2）后，其血清、尿以及动脉中的NO水平均显著回升，提示生理剂量的E2能上调去卵巢大鼠血清、尿以及动脉中的NO水平。本实验中，去卵巢组肝组织匀浆中的NO含量显著低于假手术组，而E2组肝组织匀浆中的NO含量显著高于去卵巢组。此结果与Xu等人[10]在肝纤维化大鼠（用四氯化碳处理后的大鼠）和Sakamoto[11]等人在体外培养的肝窦细胞上报道的结果相似，提示E2能上调去卵巢大鼠肝脏合成NO。

研究表明，适宜的运动能通过增加体内NO水平，达到舒张心血管、降低血压等功效[12-15]。虽然生理剂量的NO主要由血管内皮细胞和肝细胞合成[7]，但目前关于耐力运动对NO影响的研究主要集中在心血管内皮细胞[12-15]、肌肉[16]等系统，而耐力运动对肝脏 NO 影响的报道较少。在肝脏中，已知肝窦内皮细胞、枯否细胞、卫星细胞、肝细胞均能产生NO，生成的NO不仅能调节肝窦微循环，保护肝脏免受酯质过氧化毒害和纤维化，而且能通过血液循环增加血液中的NO水平，进一步调节其他组织器官的生理功能[17]。本研究中，中等强度跑台运动不仅能显著增加假手术大鼠肝组织匀浆NO含量，而且能显著增加去卵巢大鼠肝组织匀浆NO含量，表明中等强度跑台运动对大鼠肝组织匀浆NO含量的影响可能与E2的波动无关。此外，本实验结果还表明，中等强度跑台运动和E2能协同刺激去卵巢大鼠肝脏合成NO，至于二者是通过什么途径单独或协同刺激去卵巢大鼠肝脏合成NO还需进一步实验证实。

机体内NO是在NOS的作用下，由左旋精氨酸合成。已确认的NOS有三种，而肝组织内仅有iNOS和eNOS两型存在[18]。为探讨中等强度跑台运动和E2是通过调节哪种NOS上调去卵巢大鼠肝脏合成NO的，本实验采用免疫组化方法，实验结果表明，eNOS主要在各组大鼠肝窦内皮细胞和肝窦周围肝细胞的胞浆中表达，去卵巢、中等强度跑台运动和E2均不影响其在肝细胞中的表达定位。而iNOS在肝细胞中的表达定位受E2调节。在假手术组，iNOS主要表达于肝细胞胞质中，去卵巢后iNOS可由胞浆转位到核中，注射E2可逆转这种定位的变化。值得注意的是，先前 Goh 等[17]和 McNaughton 等[18]都在肝硬化患者肝脏切片中观察到eNOS由胞浆中转定位到核中的现象，查阅文献尚未见iNOS表达转位的报道。因此，E2如何调节大鼠iNOS的定位以及有何生理学意义有待进一步探讨。

NO是一种小分子气体，尽管其半衰期较短，但由于其透膜性非常好，所以其作用半径往往比较大，组织局部极微量（pmol数量级）的NO即可起到正常生理作用。由于iNOS只在炎症等病理状态下表达，因此正常肝脏NO含量应与eNOS呈正相关。一般认为，eNOS合成的NO对肝脏有益，而iNOS合成的NO对肝脏有害[19]。孙红梅报道[14]，适宜负荷的游泳训练可以提高大鼠心肌与血清cNOS活性，而长时间过度负荷游泳训练可使大鼠心肌与血清iNOS活性升高。黄腊秀等[6]在去卵巢大鼠心内神经节细胞中的实验结果表明，中等强度运动可上调去卵巢大鼠心内神经节细胞中nNOS的表达。从本实验免疫组化结果分析，中等强度跑台运动不仅能增加正常大鼠肝脏eNOS蛋白表达，而且能增加去卵巢大鼠肝脏eNOS蛋白表达，而对假手术和去卵巢大鼠肝脏iNOS表达均无明显影响。这提示，本实验选择的运动强度可能是通过上调肝脏eNOS蛋白表达而不是iNOS的表达刺激肝脏NO合成，此运动强度对肝脏发挥的可能是保护作用。

4 总结

本研究发现中等强度跑台运动和E2单独或联合作用均能显著增加去卵巢大鼠肝组织匀浆NO含量，二者可能是通过上调肝脏eNOS蛋白表达而发挥作用。

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