原子力显微镜在牛肉嫩度测定中的应用研究

李林强,昝林森,孟 嫚

(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100; 2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

原子力显微镜在牛肉嫩度测定中的应用研究

李林强1,2,昝林森1,＊,孟 嫚2

(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100; 2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

【目的】探讨原子力显微镜在牛肉嫩度测定中的应用,为肉品嫩度提供可靠、直观的测定方法。【方法】用 100、150、200mmol/L不同浓度氯化钙(CaCl2)处理牛肉,肉样真空包装后于 4℃下成熟 72h后测定剪切力、肌原纤维指数(MFI),并用原子力显微镜观察肌原纤维小片,比较三者结果。【结果】三种测定方法结果基本一致,但有一定差异,原子力显微镜观察肌原纤维小片直观地反映了肌原纤维小片化程度。【结论】原子力显微镜能直观地反映肉的嫩化情况,是对剪切力和MFI测定方法在形态学上的完善。

原子力显微镜,牛肉嫩度,剪切力,肌原纤维小片化指数

Binning等 1981年利用量子力学隧道效应研制出扫描隧道显微镜 (scanning tunnel microscope, ST M),随后Binnig与斯坦福大学的 Quate和 I BM苏黎士实验室的 Gerber1985年在 ST M基础上改进推出了原子力显微镜 (atomic force microscope,AF M)[1],两者均具有纳米级超高分辨率。但相对于 ST M和普通电镜,AF M通过其粗细只有一个原子大小的探针在非常近的距离上探索物体表面的情况,便可以分辨出其他显微镜无法分辨的极小尺度上的表面细节与特征[2]。肉质嫩度是禽肉食用品质的一个重要感官特征,也是肉品质量的重要指标[3-4]。嫩度的客观指标是剪切力值,肌原纤维小片化指数 (myofibril fragmentation index,MFI)也是衡量肉嫩度的重要指标之一。由于剪切力在测定过程中很难保持肉块厚度或肉柱直径大小一致,可能导致测定误差较大。19世纪 60年代研究发现肌肉的嫩度与肌原纤维的断裂有关[5],提出了利用肌原纤维小片化指数(myofibril fragmentation index,MFI)来考察肉质的嫩度[6],在 70年代才正式建立,相比其它嫩度测定技术而言,该方法建立的时间相对较晚,在有些方面还有待进一步研究和完善[7]。原子力显微镜是一种更为突出的显微观察技术,本文通过用不同浓度 CaCl2(100、150、200mmol/L)处理牛肉,测定剪切力和MFI,并用原子力显微镜观察肌原纤维小片,比较三者结果,拟探讨原子力显微镜在测定牛肉嫩度中的应用,以期为肉品嫩度的测定提供更为准确、可靠、直观的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

CaCl2、KCl、K3PO4、EDTA、HCl、牛血清白蛋白Roche公司;CuSO4·5H2O,NaKC4H4O6·4H2O, NaOH,KI。

C-LM型肌肉嫩度计 东北农业大学;紫外分光光度计 UV-754,上海;匀浆器 德国;冷冻离心机SCR20BC,日立;原子力显微镜 Atomic Force Microscopy,WET-SP M-9500J3,日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肉样采集与处理 2岁秦川公牛按照标准的屠宰工艺屠宰,胴体经预冷 20h后,将左右两侧背最长肌取下(第 10胸椎到第 4腰椎),在每条背最长肌上从前往后依次分割 10块厚 2.5cm肉块,然后随机分成 4组,每组 5块,一组注射肉重 10%的蒸馏水。另外 3组分别注射肉重 10%的 100、150、200mmol/L CaCl2。将注射好的肉样真空包装后于 4℃下成熟 3d后测定各项指标。

1.2.2 剪切力测定 将修整后 2.5cm厚的分割肉块真空包装于 85℃水浴加热至中心温度 80℃,取出冷却至室温并放入 4℃冷藏间过夜,然后用直径 1.27cm的中空取样器沿肌纤维方向取样。每块肉钻取 5个肉柱,然后用肌肉嫩度计垂直肌纤维方向测定每个肉柱的剪切力值。同一肉块所有的剪切力值的平均值即为该肉块的剪切力值。

1.2.3 肌纤维提取和MFI测定 去除肉样可视脂肪和结缔组织,称取约 5g,放入匀浆器,加入 10mL 2℃分离介质 (100mmol/L KCl、20mmol/L K3PO4、0.1mmol/L EDT A、1mmol/L CaCl2、溶液用 HCl调整pH为 7.0),高速低温匀浆 1min。匀浆在 4℃低温离心机 3000×g下离心 15min,然后缓慢倒出上层清液,沉淀中又加入 10mL、2℃分离介质,用搅捧制成悬液,重复上述离心步骤,倒出上层清液,加入 2.5mL分离介质于漩涡混合器上混匀,通过 200目筛网滤去结缔组织,再加 2.5mL分离介质来帮助肌原纤维通过筛孔,混匀肌原纤维悬浮液。利用标准牛血清白蛋白配制成不同浓度的蛋白,分别为 0、2、4、6、8、10mg/L,利用双缩脲法其 540nm处的吸光值,以吸光值为纵坐标,蛋白浓度为横坐标绘制标准曲线。用MFI分离介质调整悬浮液蛋白浓度为 0.5±0.05mg/mL,在 540nm测吸光度,将所得结果乘 200后便得到MFI值。

1.2.4 原子力显微镜对肌原纤维小片的测定 按照上述方法制备混匀肌原纤维悬浮液(蛋白浓度为 0.5 ±0.05mg/mL),调整悬液体积为 10mL,混匀,吸取1μL肌原纤维悬液滴于云母片上,自然风干,直接进行原子力显微镜观察。

1.2.5 数据统计分析 运用 SPSS软件进行数据处理,结果以±sD表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度 Ca2+对牛肉剪切力的影响

由图 1可知,随着 Ca2+浓度的增加,肉样剪切力呈下降趋势,表明肉的嫩度增加。不同浓度 Ca2+对牛肉处理后其剪切力均极显著下降 (Plt;0.01), 100mmol/L和 150mmol/L,150mmol/L和 200mmol/L Ca2+处理牛肉间剪切力下降差异均不显著 (Pgt; 0.05)。表明 150mmol/L Ca2+对牛肉处理嫩化效果较为理想。

图 1 不同浓度 Ca2+对牛肉剪切力的影响

2.2 不同浓度 Ca2+对牛肉MF I的影响

由图 2可知,随着 Ca2+浓度的增加,肉样MFI呈上升趋势,但 200mmol/L Ca2+处理肉样的MFI下降,与图 1嫩化结果不同。100、150mmol/L Ca2+处理肉样的MFI增加显著 (Plt;0.05),200mmol/L Ca2+处理肉样的MFI相对 100、150mmol/L Ca2+处理肉样的MFI下降显著 (Plt;0.05),这与上文剪切力测定结果不同。表明 150mmol/L Ca2+对牛肉处理嫩化效果较为理想,与上文分析结果基本一致,但处理间结果比较的差异不同。

图 2 不同浓度 Ca2+对牛肉MFI的影响

2.3 原子力显微镜对肌原纤维小片测定

由图 3可知,对照肉样肌原纤维呈网状连接,分离小片极少;随着 Ca2+浓度的增加,处理肉样肌原纤维小片依次显著增多。肌原纤维小片越多,表明肌原纤维降解越多,肉的嫩度越大,可知,100、150、200mmol/L Ca2+处理肉样嫩度依次增大,这与剪切力测定结果相似,但与以MFI作为嫩化指标有一定差异。又由图 3可知,100mmol/L Ca2+处理肉样肌原纤维直径较大约为 2.5μm,150mmol/L Ca2+和200mmol/L Ca2+处理肉样肌原纤维直径约为 1μm,由于肌原纤维直径是影响肉嫩度的主要因素之一[8-10],因此, 150mmol/L Ca2+和 200mmol/L Ca2+处理肉样的嫩度要远远高于 100mmol/L Ca2+处理肉样和对照嫩度,这与上文剪切力和MFI测定结果有一定的差异。

3 讨论

本实验所采用的 3个浓度水平的 Ca2+处理,以剪切力、MFI作为嫩化指标,结果表明,牛肉嫩度改善显著(Plt;0.05),与原子力显微镜观察测定肌原纤维小片结果基本一致。但剪切力测定结果表明,150、 2 0 0 m m o l／LC a2+对牛肉处理间结果差异不显著(Pgt; 0.05),MFI测定结果表明,150mmol/LCa2+比100mmol/L Ca2+处理牛肉嫩度显著 (Plt;0.05),这与原子力显微镜测定测定肌原纤维小片结果有所不同。原子力显微镜测定结果表明,200、150、100mmol/L Ca2+处理肉样嫩度依次增大,而且处理间结果差异显著。剪切力一般通过剪切力仪或质构仪剪切测定获得,是用中空取样器沿肌纤维方向取样,然后用剪切力仪或质构仪垂直肌纤维方向测定肉柱的剪切力值。由于肉样易变形,即使是同一肉柱直径大小也不一,导致测定误差较大,影响处理间差异的比较。MFI测定是通过制备肌原纤维悬浮液,通过肌原纤维悬浮液的吸光值来表示嫩度,是一种间接测定肉嫩度的方法,由于肌原纤维小片的大小对吸光值的影响较大,另外,在制备肌原纤维悬浮液的过程中匀浆速度、匀浆时间均影响肌原纤维断裂指数测定[11-12]。因此,剪切力和 MFI测定值并不能完全反映肉的嫩化情况。而原子力显微镜通过测定肌原纤维小片化指数及肌原纤维直径较能准确、直观地反映肉的嫩化情况,是对MFI测定方法的改进和完善,同时又克服了剪切力测定不能直接观察的缺点,因此,原子力显微镜是研究肉质嫩度的有力工具,但其标准化操作还应进一步研究。

图 3 不同浓度 Ca2+对肌原纤维小片化的影响

4 结论

原子力显微镜能直观地反映肉的嫩化情况,是对剪切力和MFI测定方法在形态学上的完善,是研究牛肉嫩度有力的辅助工具。

[1]Binning G C,F Quate,C Gerber,et al.Atomic force microscope[J].Physics Review Letter,1986(4):930-933.

[2]唐卓,戴如春,廖二元 .原子力显微镜在骨微纳观结构与功能研究中的应用 [J].中国医学物理学杂志,2008,25(6): 911-915.

[3]Goodson K J,MorganW W,Reagan J O,et al.Beef customer satisfaction:Factors affecting consumer evaluations of clod steaks [J].Ani mal Science,2002,80(2):401-408.

[4]Shackelford S D,Wheeler T L,Meade M K,et al.Consumer impressions of tender select beef[J].American Society of Animal Science,2001,79(10):2605-2614.

[5]Takahashi K,Fukazawa T,Yasui T,et al.Formation of myofibrillar fragments and reversible contraction of sarcomeres in chicken pectoralmuscle[J].Food Science,1967,32(4):409-412.

[6]Moller A J,Vestergarrd T,W is mer-Pederson J.Myofibril fragmentation in bovine longissimusdorsiasan index of tenderness[J].Food Science,1973,38(5):824-825.

[7]郑海波 .肌原纤维断裂指数及其与肉质嫩度的关系[J].肉类研究,2007,99(5):13-16.

[8]Koohmaraie M,Kent M P,Shackelford S D,et al.Meat tenderness andmuscle growth:is there any relationship?[J].Meat Science,2002,62(3):345-352.

[9]Ahnstrom M L,EnfaltA C,Hansson I,et al.Pelvic suspension improves quality characteristics in M.semimembranosus from Swedish dual purpose young bulls[J].Meat Science,2006,72 (3):555-559.

[10]White A,O’Sullivan A,Troy D J,et al.Effects of electrical stimulation,chilling temperature and hot-boning on the tenderness of bovine muscles[J].Meat Science,2006,73(2): 196-203.

[11]Hopkins D L,Martin L,Gilmour A R.The impact of homogenizer type and speed on the determination of myofibrillar fragmentation[J].Meat Science,2004,67(4):705-710.

[12]Olson D G,Parrish F C,Stromer M H.Myofibril fragmentation and shear resistance of three bovine muscle during postmortem storage[J].Food Science,1976,41(5):1036-1041.

Study on application of atomic force microscopy in beef tendernessmeasurement

L IL in-qiang1,2,ZAN L in-sen1,＊,M ENGMan2
(1.College ofAnimal Science and Technology,Northwest Sci-Tech University ofAgriculture and Forestry,Yangling 712100,China;2.College of Food Engineering and Nutritional Science,ShaanxiNor malUniversity,Xi’an 710062,China)

【O b jec tive】App lica tion of a tom ic force m ic roscop y in beef tende rness m easurem ent was s tud ied to supp ly re liab le and intuitive m e thod for m ea t tende rness m easurem ent.【M e thod】Beef was tende riza tion trea ted w ith100,150and200mm ol/L ca lc ium chloride(CaC l2);itwas vacuum-p acked s tored a t4℃for three days,shea r force and m yofib ril fragm enta tion index(M FI)was m easured,and m yofib ril fragm enta tion was obse rved w ith a tom ic force m ic roscop y(AFM)wha teve r results we re comp a red w ith.【Result】The results of the three kindsof de te rm ina tion m e thod we re the sam e bas ica lly.But the re was a little d iffe rent.M yofib ril fragm enta tion deg ree was intuitive ly reflec ted by AFM obse rva tion.【Conc lus ion】AFM can intuitive ly reflec t the beef tende rness change in tende riza tion.It can p e rfec t shea r force and M FIm easurem entm e thod on m orp hology.

a tom ic force m ic roscop e;beef tende rness;shea r force;m yofib ril fragm enta tion index

TS251.7

A

1002-0306(2010)02-0111-03

2009-03-19 ＊通讯联系人

李林强(1971-),男,博士研究生,研究方向:畜产品及功能食品研究。

农业部公益性行业专项 (nyhyzx07-035);国家科技支撑计划-农林动物育种专项 (2006BAD01A10-3);陕西省“13115”科技创新工程(2007ZDCY-01)。