水解程度对小麦水解蛋白美拉德反应产物的影响及在烟用香料中的应用

刘 珊,刘 洋

(中国烟草总公司郑州烟草研究院,河南郑州 450001)

水解程度对小麦水解蛋白美拉德反应产物的影响及在烟用香料中的应用

刘 珊,刘 洋

(中国烟草总公司郑州烟草研究院,河南郑州 450001)

选择胰蛋白酶催化小麦蛋白水解,将水解蛋白与葡萄糖进行美拉德反应制备适合卷烟应用的香料。利用正交实验确定了最佳水解条件：底物浓度 9%,加酶量 3%,体系 pH8,水解温度 50℃。同时通过控制水解时间得到水解程度不同的水解蛋白,考察了水解程度对美拉德反应产物的影响。结果表明,在本文所选择的水解条件下,水解时间为10h的小麦水解蛋白的美拉德反应产物具有较好的卷烟加香效果,能够改善参比卷烟的香气质,增加香气量,使烟气增浓柔顺,提高细腻度与透发性。

小麦蛋白,水解程度,美拉德,烟用香料

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦蛋白 小麦活性谷朊粉,宝鸡源盛实业有限公司;葡萄糖 市售食品级;木瓜蛋白酶 标注活力 8×105u/g,广州远天酶制剂厂;胰蛋白酶 标注活力 3000u/g,杭州三叶生物工程公司;中性蛋白酶 标注活力 5×104u/g,无锡酶制剂厂;甲醛 莱阳市双双化工有限公司;氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸、氯化钠、无水乙醚、无水硫酸钠 分析纯,天津化学试剂三厂。

电子天平 T D,浙江余姚金诺天平有限公司;电子天平 BP121S,Sartorius;台式大容量离心机L-550,长沙湘仪离心机有限公司;磁力搅拌器 85-1,上海司乐仪器有限公司;酸度计 pHS-3S,上海宇隆仪器有限公司;水浴恒温振荡器 SHA-A,江苏金坛市环宇科学仪器厂;实验室香精香料注射仪C ILECTOR burghart公司;旋转蒸发仪 RE-3000,上海亚荣生化仪器厂;气质联用仪 6890N GC/5975 MS,美国惠普公司;Waters 2695高效液相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦水解蛋白的制备 将小麦蛋白与水混合均匀,加入酶制剂后置于恒温水浴振荡器中进行水解。水解结束后沸水浴加热 5min灭酶,迅速冷却至室温,4000r/min离心分离得到上清液即为水解蛋白。

1.2.2 水解蛋白氨态氮含量及氨态氮生成率的测定

氨态氮含量：采用甲醛滴定法[3];总蛋白氮：采用微量凯氏定氮法[3]。

1.2.3 水解蛋白中肽分子量分布的测定 采用高效凝胶过滤色谱法[4]。Waters 2695高效液相色谱仪(2487紫外检测器和 Empower Pro工作站)。

色谱柱：Waters Protein-Pak 125Å300mm × 7.8mm;流动相：乙腈/水/三氟乙酸为 45/55/0.1 (V/V);检测波长：UV220nm;流速：0.5mL/min;柱温：30℃。

分子量校正曲线所用标准品：细胞色素 C (MW12500),杆菌酶(MW1450),乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸 (MW451),乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)

校正曲线：Log分子量 =7.634-0.256T R2=0.9959

1.2.4 美拉德反应产物的制备 将水解程度不同的小麦水解蛋白分别与葡萄糖按糖氮比 2∶1混合均匀,于常压 100℃加热回流反应3h,反应完毕后迅速冷却至30℃以下。

1.2.5 反应过程中体系氨态氮损失率的测定 计算公式如下：

氨态氮损失率 (%)=反应前体系氨态氮含量(%)-反应后体系氨态氮含量 (%)/反应前体系氨态氮含量(%)×100%

1.2.6 水解蛋白美拉德反应产物的感官评价[5]将美拉德反应产物以适量去离子水稀释,按照 500ppm/支的注射量加入参比卷烟,加香烟支于相对湿度 65%,温度为 22±2℃环境平衡 24h后,由专家组进行评吸。

1.2.7 水解蛋白美拉德反应产物的醚溶性成分分析取 10mL美拉德反应产物,加入氯化钠使其饱和,分别用 40、40、20mL无水乙醚萃取,合并有机相,以无水硫酸钠干燥过夜,过滤后加入乙酸苯乙酯内标溶液,常压浓缩至 1mL备用,进行 GC-MS分析。

GC-MS条件：HP-FFAP毛细管柱：30m × 0.25mm×0.25μm;载气为 He;柱流速：0.6mL/min;进样口温度 250℃;程序升温：;进样量 1μL;分流比 10∶1;传输线温度：280℃;电离电压：70eV,质量数范围：30～400amu。

2 结果与讨论

2.1 不同蛋白酶对小麦蛋白水解能力的比较

在酶的理论最适条件,分别以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶按相同底物浓度 ([S]=9%, w/w)和加酶量 ([E]/[S]=2%,w/w)水解小麦蛋白,以体系中氨态氮含量表示水解程度。如图 1所示,胰蛋白酶的水解能力高于中性蛋白酶和木瓜酶。胰蛋白酶催化专一性强,主要作用于碱性氨基酸(精氨酸与赖氨酸)的羧基和其它氨基酸的氨基组成的肽键,产生具有碱性氨基酸末端的肽。肽段的反应活性受末端氨基酸的影响,而碱性氨基酸的美拉德反应活性较高,故选择采用胰蛋白酶水解小麦蛋白。

图 1 不同蛋白酶对小麦蛋白水解能力的比较

2.2 胰蛋白酶水解小麦蛋白条件优化

以底物浓度、加酶量、体系 pH、水解温度为因素,以水解 10h的氨态氮生成率为考察指标,采用L9(34)正交实验对各种条件进行筛选,建立最佳的胰蛋白酶水解工艺。如表 1所示,由极差分析可知,在本实验选择的因素和水平条件下,因素影响的次序为B＞A＞D＞C,即加酶量对氨态氮生成率的影响最大,其次为底物浓度,而水解温度和 pH影响均较小。最佳方案为 A2B3C2D2,即底物浓度为 9%,加酶量为 3%,体系 pH为 8,水解温度为 50℃。

表 1 胰蛋白酶水解小麦蛋白正交实验结果

2.3 水解时间对氨态氮生成率的影响

以正交实验确定的条件下水解小麦蛋白。如图2所示,随着水解时间延长,小麦蛋白分子中的肽键不断打开,游离氨基数量不断增加,10h内表现为氨态氮含量迅速升高。之后由于酶活的下降以及浓度不断增大的水解物对蛋白酶的抑制作用,水解速率逐渐降低,氨态氮含量增加幅度减小。当水解时间达 24h,氨态氮含量无明显增加。

表 2 不同水解程度小麦水解蛋白美拉德反应产物的感官评价

图2 水解时间对氨态氮含量的影响

2.4 水解时间对小麦水解蛋白中肽分子量分布的影响

根据图 3凝胶色谱图峰形特点可将水解过程分为几个阶段。水解初期 1～3h内,水解蛋白分子量分布范围主要分为五段,即 14～26、850～14、300～850、150～300、＜150kDa。1h水解蛋白中各肽段分别占总量的 0.47%、15.71%、32.28%、27.73%及 23.81%,而 3h相对于 1h水解蛋白在分子量 ＞300kDa范围的组分含量有所减少,而分子量 ＜300kDa范围的组分含量有所增加。6h和 10h水解蛋白分子量分布具有相似的峰形,并且分子量 14～26kDa范围的大分子组分迅速减少,而分子量 ＜850kDa范围的组分占总肽含量的 95%以上,主要是由 6～7个以下氨基酸组成的肽。当水解时间达到 24h时,水解蛋白中分子量＜300kDa的组分占 82%以上,主要由二肽三肽及游离氨基酸组成。

图 3 不同水解时间小麦水解蛋白中肽分子量分布

2.5 水解程度对水解蛋白美拉德反应产物的影响

2.5.1 水解程度对反应过程氨态氮损失率的影响 图 4为不同水解程度小麦水解蛋白在美拉德反应过程中氨态氮的变化。随着水解时间的延长,水解蛋白中氨态氮含量不断增加,但在反应过程中氨态氮的损失率却呈波动变化,其中水解时间为 6h与10h的水解蛋白氨态氮损失率较高。由于不同水解程度水解蛋白的分子量分布不同,肽和氨基酸的组成亦不同,氨态氮损失率的波动变化可能是由不同分子大小的肽以及不同的末端氨基酸的反应活性不同造成的。

图 4 水解时间对美拉德反应产物氨态氮损失率的影响

2.5.2 水解程度对美拉德反应产物卷烟加香效果的影响 不同水解程度水解蛋白的美拉德反应产物对参比卷烟均有一定作用,但作用效果和作用程度各有不同。如表 2所示,低度水解的水解蛋白美拉德反应产物不同程度上存在刺激较大的缺陷,可能是由于产物中含有未降解或降解率低的大分子蛋白肽,其反应活性低,若含量过高则在烟支燃烧时产生副作用。而当水解程度继续提高,低分子肽与游离氨基酸含量不断增加,并不能继续提高反应产物的加香效果,反而使加香的卷烟吸食品质变差。综合考虑,在本文所选取的几种水解程度范围内,10h水解蛋白美拉德反应产物具有较好的加香效果。

2.5.3 水解程度对美拉德反应产物醚溶性成分的影响 如表 3所示,随着水解程度增加,水解蛋白美拉德反应产物中的吡嗪类物质有所减少,呋喃类与吡咯类物质有所增多,同时酸类物质有所增多。而加入反应产物后参比卷烟的吸食品质正是这些物质综合作用的结果。香味物质种类与量的增加可使香气质和香气量有所改善,但是继续增加带来的不谐调以及酸类物质增加,特别是低级脂肪酸类物质的增加,都会给卷烟带来负面的影响。

3 结论

通过控制水解时间可控制小麦蛋白的水解程度,得到分子量分布与末端氨基酸组成不同的产物。由于肽段长度与末端氨基酸均影响氨基化合物的美拉德反应活性及产物组成,故不同水解程度的水解蛋白的美拉德反应产物具有不同的特点。结果表明,在本文所选择的水解条件下,水解时间为 10h的小麦水解蛋白的美拉德反应产物具有较好的卷烟加香效果,能够改善参比卷烟的香气质,增加香气量,使烟气增浓柔顺,提高细腻度与透发性。

表 3 水解程度对小麦水解蛋白美拉德产物醚溶性成分的影响

[1]杨叶昆,李雪梅,等 .酪蛋白的酸水解及其棕色化反应产物在卷烟加香中的应用[J].烟草科技,2001(1)：8-10.

[2]杨叶昆,李雪梅,等 .酪蛋白的酶促水解及其水解物的美拉德反应[J].食品科学,2003(4)：104-107.

[3]大连轻工业学院,华南理工大学合编 .食品分析[M].中国轻工业出版社,1994.

[4]QB/T 2653-2004大豆肽粉附录A[S].

[5]谢剑平,宗永立,等 .单体香料在卷烟中作用评价方法的建立与应用[J].烟草科技,2008(4)：5-9,13.

Effect of degree of hydrolysis onMaillard reaction products of wheat protein hydrolysates and application in tobacco flavoring

L IU Shan,L IU Yang
(Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China)

In this p ap e r tryp s in was se lec ted to ca ta lyze the hyd rolyza tion of whea t p rote in.The hyd rolysa tes we re reac ted w ith g lucose to p roduce tobacco flavoring.The hyd rolys is ofwhea t p rote in was s tud ied through orthogona l tes t des ign.It was found tha t the op t im um cond itions we re：the concentra tion of subs tra te was9%,the ra tio of tryp s in to subs tra te was3%,pH was8and temp e ra ture was50℃.Hyd rolysa tes w ith d iffe rent deg ree of hyd rolys is we re p rep a red by controlling hyd rolys is t im e.Hyd rolys is t im ehad effec t not only on thecons titution of the hyd rolysa tes but a lso on the M a illa rd reac tion p roduc ts.Result showed tha t unde r the op t im um cond ition the p roduc ts of hyd rolysa tes w ith10h could d is tinc tly imp rove the sensory qua lity of tobacco.

whea t p rote in;deg ree of hyd rolys is;M a illa rd;tobacco flavoring

TS201.2+1

A

1002-0306(2010)02-0127-04

美拉德反应是形成烟草特征香味的重要反应,在烟用香料合成方面的应用十分广泛。国内外相关研究多采用单一氨源 (如氨基酸)和各种还原糖类,导致成本过高且香味成分相对单一。现代美拉德反应已开始倾向于利用天然原料,如采用水解蛋白作为氨源,利用植物提取物及淀粉水解糖等作为糖源。天然氨源的美拉德产物在烟草制品中取得了良好应用,多数研究采用酸法水解动植物蛋白[1],虽水解效率高,但需高浓度强酸溶液,对设备要求高且水解物需大量碱中和。而采用酶法水解技术多为长时间水解[2],使深度水解的蛋白质发生美拉德反应,并未针对水解程度对水解蛋白美拉德反应产物的影响进行研究。而通过控制水解时间可得到水解程度不同的水解蛋白,从而制备不同组成的美拉德反应产物,得到具有不同特点的烟用香料。

2009-04-01

刘珊(1977-),女,硕士,工程师,主要从事烟用香料的开发与应用。