辽宁省2004-2008年布鲁氏菌病流行病学现状及分型分析*

毛玲玲,姚文清,耿英芝,秦彩明,李 鑫,孙广玖,刘权恕,张 旭,李松岩,陈静乙

2.营口市疾病预防控制中心,营口 115004;

3.锦州市疾病预防控制中心,锦州 121004;

4.铁岭市地方病防治所,铁岭 112000;

5.中国医科大学,沈阳 110001

布鲁氏菌病(Brucellosis),简称布病,是由布鲁氏菌属(Brucella)的细菌侵入机体所引发的传染-变态反应性人兽共患传染病。布鲁氏菌侵入机体后可引起神经、生殖、循环、免疫等系统的损伤,常伴随菌血症,毒血症,严重时可造成伤残甚至死亡〔1〕。近十几年,我国人间布鲁氏菌病疫情持续上升。辽宁省的布病疫情居于全国前列,也呈上升趋势,对人民生命财产安全造成了巨大的威胁。历史上辽宁省曾有牛种布病流行。为了解疫情和查明菌型特征,我们对临床发热病人进行了血清抗体检测及病原分离培养,对分离到的布鲁氏菌株进行噬菌体裂解及分子生物学等分型研究。

1 材料与方法

1.1 人间疫情调查 发病资料从流行病学个案调查表和传染病网络直报系统获得。

1.2 发热病人中布鲁氏菌感染率调查 收集定点医院发热患者血清,进行SAT试验检测。SAT试验操作按文献〔2〕73-75进行 。

1.3 病原分离鉴定 床边无菌操作,接种需氧血培养瓶,放入自动血培养仪,待指示有菌生长,转种血平皿或布氏琼脂斜面分纯、保存、鉴定。

1.4 生物噬菌体分型 醋酸铅纸条、三胜黄素溶液由本室自制,参考菌株、试管凝集试剂及对照、Wb、Bk2、Tb噬菌体 、布病阳性血清、A 、M 分型血清、硫堇纸片、碱性复红纸片均由国家CDC传染病所提供,有效期内使用。噬菌体裂解实验按文献〔2〕19-27进行。

1.5 分子生物学分型鉴定 细菌DNA提取按照Qiangen核酸提取试剂盒说明书进行。BCSP31-PCR引物及扩增体系均参考文献〔3〕进行;AMOSPCR引物及扩增体系均参考文献〔4〕进行;多重PCR根据布鲁氏菌6个种的差异基因设计5对引物,用混合体系PCR对布鲁氏菌进行鉴定。引物及扩增体系均参考文献〔5-6〕进行。

2 结 果

2.1 人间疫情情况 历史上辽宁省布病疫情持续存在,但处于低流行态势,发病率在0.025/10万左右;但到1994年后疫情明显回升,1994-2002年发病率波动在0.16/10万～0.67/10万之间,2003年开始疫情明显上升,2004年发病率达2.50/10万,近几年发病率在0.80/10万～1.43/10万,居于全国前列。

图1 1999-2009年辽宁省布病发病数、发病率Fig.1 Brucellosis incidence and morbidity in 1999-2009 of Liaoning province

2.1.1 时间分布 辽宁省人间布病发病时间主要集中在3～7月,与从事畜牧业生产季节相关。

2.1.2 地区分布 历史上辽宁省北部的铁岭、抚顺为布病高发地区。但近5年来,辽西、辽南的发病上升显著。2004-2008年间,我省布病发病率居于前3位的地区分别为锦州、葫芦岛、营口。锦州市发病率为3.60/10万～8.2/10万之间,明显高于全省。

2.1.3 人群分布 性别主要以男性为主。20～50岁的青壮劳动力为主。如2004年男性病例813例,占78.25%,20～50岁 804例,占 74.75%。主要集中在农民、牧民等职业上。2004-2008年农民病例占77.38%,以上人群从事饲养羊群,接触感染机会较多。

2.2 发热病人中布鲁氏菌感染率调查 2004-2008年检测发热患者血清1 093例,采用RBPT初筛、SAT检测确定,布病抗体阳性患者 216名,平均阳性率为 21.59%。其中2004年阳性率最高,为33.33%,2007年阳性率最低,为 16.67%,详见表1。

表1 2004-2008年发热病人血清SAT检测结果Table 1 SAT serum antibody result of the patients with fever in 2004-2008

2.3 病原分型鉴定

2.3.1 菌株常规鉴定及生物分型结果 2004-2008年间,从患者血液(31份)、骨髓(1份)标本中共分离到32株布鲁氏菌,其中20株布鲁氏菌分离于营口地区,7株布鲁氏菌分离于锦州地区,铁岭、鞍山地区各分离到2株布鲁氏菌,抚顺地区分离到1株布鲁氏菌。对以上菌株进行常规鉴定、噬菌体裂解分型。29株菌被鉴定为羊种3型布鲁氏菌,其余3株为BK噬菌体裂解,Tb、Wb噬菌体不裂解,阳性血清凝集,而A、M 因子血清未见清晰凝集,较羊种菌有较多H2S产生,定为变异布氏菌株。

2.3.2 BCSP31-PCR结果 32株布鲁氏菌在223 bp处均出现特异性扩增条带,从分子水平证明这32株菌均属于布鲁氏菌属,见图2。

图2 部分菌株BCSP31-PCR扩增结果M：DL2000 DNA Ladder;1～5：待测分离株;-：阴性对照,+：羊种布氏菌对照Fig.2 The BCSP31-PCR amplification results of a part of strains

2.3.3 AMOS-PCR分型结果 通过AMOS-PCR分型检测,32株布鲁氏菌在731 bp处出现条带,从而证明这32株菌均为羊种布鲁氏菌,见图3。

2.3.4 多重PCR分型鉴定结果 通过多重PCR分型检测,32株布鲁氏菌在1 682 bp、1 071 bp、794 bp、152 bp处出现条带,而272 bp处特异性条带缺如。从而证明这 32株菌均为羊种布鲁氏菌,见图4。

3 讨 论

通过对辽宁省2004-2008年布病疫情的分析,发现了疫情的严重性。定点医院发热病人进行布病血清抗体检测,布病发病 219人,阳性率为21.59%,可见我省布病疫情的严重程度。辽宁省相邻各省都是布鲁氏菌病高发区,全省农村是农牧混杂地区,青壮年农民进行畜牧养殖较多,与牲畜接触的机会多,布病发病的季节性规律为2～3月份屠宰、接产高峰感染,3～4月份发病,5～6月份就诊,得到疫情报告。农村牲畜买卖频繁,检疫、免疫无保障。群众缺乏布病防治知识,造成布病近年高发疫情,而且青壮年是主要疫情防治对象。

对32株布氏菌分型看出辽宁省的优势流行菌型为羊3型。通过对193例病例的流行病学个案调查,结果表明感染病例主要为接触病羊感染,占89.12%。可见辽宁省布鲁氏菌病传染源主要是患病的羊,建议羊布病为传染源防病重点。

国际公认的布鲁氏菌鉴定方法对流行病学分析和布病的防治有很大意义。但是非典型菌株多有出现。本研究中就有3株变异菌株。用分子生物学分型方法对这些非典型菌株进行鉴定已成为新的发展方向。本次研究运用 BCSP31-PCR、AMOS-PCR以及多重PCR 3种方法,同时对32株布鲁氏菌进行了实验,均鉴定为羊种布鲁氏菌。克服了菌株变异因素,可以作为传统分类方法的补充。对于3株变异菌株,在多重PCR扩增结果中可以看到,其条带与其他菌株的条带略有不同,说明这3株菌在基因水平上发生了变异,提示是进一步研究的方向。

〔1〕王季秋.布氏菌病各系统损伤的研究进展〔J〕.中国地方病防治杂志,2002,17(5)：277-280.

〔2〕肖东楼.布鲁氏菌病防治手册〔M〕.1版.人民卫生出版社,2008：73-75,19-27.

〔3〕邓小玲,陈经雕,柯碧霞,等.广东省布鲁氏菌分离株的分子特征分析〔J〕.中国人兽共患病学报,2008,24(9)：851-854.

〔4〕姜海,崔步云,赵鸿雁等.AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用〔J〕.中国人兽共患病学报,2009,25(2)：107-109.

〔5〕Garcia-Yoldi D,Marin C M,de Miguel M J.et al.Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all brucella species and the vaccine strainsBrucella abortusS19 and RB51 andBrucella melitensisRev1〔J〕.Clinical Chemistry,2006,52(4)：779-781.

〔6〕刘国栋,刘国栋,刘荣臻,等.布鲁氏菌多重聚合酶链反应鉴定研究〔J〕.疾病监测,2008,23(5)：271-273.