人粒细胞无形体病*

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近年来,我国某些省份一些群众被蜱叮后发生无形体感染或疑似无形体感染,为之,特将国内外有关人粒细胞无形体病的调研工作概述如下。

1990-1993年间,在美国Minnesota和Wisconsin州发现多个急性发热的病人的中性粒细胞的胞质内有埃立克体样包涵体。血清学分析也证明这些病人与人单核细胞埃立克体病(Human monocytic ehrlichiosis,HME)的病原体(Ehrlichia chaf f eensis)无关,而与马埃立克体(E.equi)和嗜吞噬细胞埃立克体(E.phagocytophilium)相关。1994年,Chen等用PCR从病人血标本扩增到该嗜粒细胞病原体的16S rRNA基因,经序列分析证明该病原体与马埃立克体和嗜吞噬细胞埃立克体密切相关〔1〕。1995年,Goodman等用人的粒细胞白血病细胞系(H L-60)从病人血标本分离到该嗜粒细胞病原体,将它命名为人粒细胞埃立克体,其所致感染则称为人粒细胞埃立克体病(Human granulocytic ehrlichiosis,HGE)〔2〕。经 16S rRNA 基因序列的系统发育分析,发现这些从动物与人分得的嗜粒细胞病原体与无形体属病原体最相关,因此将它们归为无形体属的一个新种,正式命名为无形体科(Anaplasmataceae)内无形体属(Anaplasma)的一个种(嗜吞噬细胞无形体A.phagocytophilum),其所致感染改为人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)〔3〕。

1 病原特征

1.1 形态结构 嗜吞噬细胞无形体呈球状多型性,主要寄生在粒细胞的胞质空泡内,几个或十几个菌体聚集形成的一个包涵体〔4〕。用Wright法染色,嗜吞噬细胞无形体包涵体在胞质内染成紫红色,见图1。

人粒细胞白血病细胞(HL-60)类似人的正常骨髓前质细胞,具有嗜中性粒细胞的功能。嗜吞噬细胞无形体在H L-60细胞内生长繁殖十分迅速,电镜观察发现它在HL-60细胞内主要存在与膜结构相连的空泡内。嗜吞噬细胞无形体早期的形态多为圆形的密度较大的网状体,在后期菌体变小但密度增大 ,见图 2〔5〕。

1.2 抗原结构 嗜吞噬细胞无形体的44 kDa外膜蛋白基因全长1 333 bp,编码439个氨基酸。嗜吞噬细胞无形体的染色体上有多个与44 kDa外膜蛋白基因同源的基因,存在一个44 kDa外膜蛋白基因家族〔6〕。用嗜吞噬细胞无形体感染血清筛选该病原体的基因文库,发现该病原体的160 kDa、130 kDa和100 kDa等3个大分子抗原蛋白基因。另外,生物素标记嗜吞噬细胞无形体的蛋白质组分析发现Omp85 、Asp62、Asp55、P44、Omp-1A 等5 个主要表面蛋白,其中Asp62和Asp55能够与HGA患者血清所识别〔7〕。

1.3 基因组 嗜吞噬细胞无形体的基因组为1,471,282 bp,G+C含量为41.6%,含有1,369个编码框〔8〕。该小基因组经过多次减数进化已经丢失许多功能基因,因此嗜吞噬细胞无形体必须依赖宿主细胞生长、繁殖,但其仍具有核酸、维生素、辅因子合成基因〔8〕。从病人分离的嗜吞噬细胞无形体与从马和牛分离的嗜吞噬无形体的16S rRNA基因的差异仅1～3个碱基(0.1～0.2%),充分证明它们属于同一个种〔3〕。

2 流行病学

在美国有21个州发现HGA,主要集中在东北部,中西部和西海岸也有病人。仅1998年被查证HGA病人有数百病例。血清学分析证明某些欧洲国家也有该病的存在,在斯洛文尼亚已有多个HGA病例被证实。我国学者用嗜吞噬细胞无形体特异PCR检查蜱咬后发热病人的血标本,获得阳性结果〔8〕,并发现 HGA 病例或疑似 HGA 病例〔8-9〕,我国学者已从东北地区的野鼠和发病羊血标本分离到3株嗜吞噬细胞无形体〔10〕。

2.1 传播媒介 美国每年的4月到 12月均有HGA病例出现,但高峰期为6月和7月,与流行地的蜱活动期相吻合,已证实肩突硬蜱是该病的传播媒介。肩突硬蜱是也是莱姆病病原体的携带和传播者,用PCR方法从HGA流行区的肩突硬蜱中同时扩增出HGA和莱姆病病原体DNA〔7〕。另外美国肩突硬蜱还是微小巴比原虫(Babesia microti)、某些脑炎病毒的携带和传播者,约10%的HGA患者有莱姆病或巴比原虫病共感染的血清学证明〔11〕。

全钩硬蜱为我国主要硬蜱属蜱(I.persulcatus),为莱姆病的传播媒介。我国学者采用嗜吞噬细胞无形体特异PCR检测新疆、内蒙、黑龙江等地的全沟硬蜱,阳性率分别为3.2%、6.3%、0.8%〔8〕。

2.2 自然宿主 美国肩突硬蜱寄生于白尾鹿(Odocoileusvirginianus)身上,研究证明美国的白尾鹿是嗜吞噬细胞无形体的贮存宿主〔7〕。另外,在实验室用肩突硬蜱和小鼠成功地模拟出嗜吞噬细胞无形体在蜱与啮齿动物之间循环,证明野外啮齿动物是嗜吞噬细胞无形体的重要贮存宿主。

3 发病机制

嗜吞噬细胞无形体通过蜱叮咬进入体内,经微血管或淋巴道进入血流和脏器。采用免疫组化在HGA病人和实验感染动物的肝、脾、骨髓和淋巴结等网状内皮系统的器官组织中均发现嗜吞噬细胞无形体〔11〕。

3.1 嗜吞噬无形体直接损伤宿主细胞〔2,11〕嗜吞噬细胞无形体进入血流后,其主要寄生于嗜中性粒细胞内。嗜吞噬细胞无形体的嗜中性粒细胞特性可能与它表面存在的选凝素-P(P-selectin)配体有关。用抗白细胞选凝素配体的单克隆抗体预先与嗜吞噬细胞无形体结合,可以阻止嗜吞噬细胞无形体与嗜中性粒细胞结合以及其后的细胞内入侵。嗜吞噬细胞无形体在吞噬细胞内生长和过量繁殖可直接引起细胞的裂解。另外还发现粒细胞系和单核细胞系的初始骨髓祖细胞对嗜吞噬细胞无形体感染敏感,这可能是HGA病人的白细胞计数下降的一个重要原因。

3.2 嗜吞噬细胞无形体抑制噬中性粒细胞的呼吸爆发〔12-13〕嗜中性粒细胞在机体的防御系统中是一主要效应细胞。嗜中性粒细胞吞噬入侵的病原菌后发生呼吸爆发,产生大量的超氧离子(O2-),超氧离子能够有效地杀伤病原菌。但是,嗜吞噬细胞无形体在嗜中性粒细胞内不但不损伤,而且在细胞内大量繁殖,证明嗜吞噬细胞无形体能够抑制嗜中性粒细胞的呼吸爆发。

3.3 HGA的病理损伤与机体免疫因素有关〔11,14〕

嗜吞噬细胞无形体侵入组织的吞噬细胞后引起机体的免疫应答,免疫应答使淋巴细胞和吞噬细胞在感染部位浸润造成局部组织的炎性损伤,免疫应答的某些免疫细胞激活和细胞因子的释放可加重嗜吞噬细胞无形体感染后的组织损伤。研究发现γ干扰素在感染早期可促进体内嗜吞噬细胞无形体清除,后期却使组织损伤加重。

3.4 病理学检查〔7,11〕通过对HGA死亡病人 尸检和组织病理学检查,发现嗜吞噬细胞无形体的主要靶细胞为成熟的粒细胞,免疫组化检查发现血液、脾脏、肺、肝脏等器官的嗜中性粒细胞中存在嗜吞噬细胞无形体,感染器官组织有较明显的病理改变。

检查死者脾脏发现巨噬细胞浸润、浆细胞数量的增加,并可见噬红细胞和白细胞现象以及细胞凋亡。淋巴结检查也发现类似脾脏的病变。一死亡儿童的尸检发现有明显的淋巴腺炎,其淋巴结组织有严重的嗜中性粒细胞浸润和巨噬细胞聚集以及副皮质增生。HGA病人的骨髓检查发现淋巴细胞浸润和浆细胞数量增加,泡沫样组织细胞增多和噬红细胞现象。

肝脏组织病理学检查发现有淋巴细胞浸润,并有淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等细胞的聚集;肝脏的Kuppfer细胞数量增加且发现有肝细胞的凋亡等。肺的病理改变主要为肺间质的淋巴细胞浸润、肺组织水肿、肺泡内出血等。

4 临床特征

4.1 临床表现 根据Bakken等对确诊的41例HGA病人的观察,它们的平均潜伏期为8天,所有的病人均有发热合并寒战,绝大部分有疲乏、肌痛〔4〕;白细胞减少、血小板减少以及转氨酶升高是HGA临床诊断的重要依据;急性呼吸窘迫综合征或/和急性肾衰是HGA患者死亡的主要原因,死亡多见于有继发感染的老年患者,死亡率为HGA住院病人的7～10%〔4,7,11〕。HGA 患者少见出现神经系统异常,其它临床表现见表1。

表1 41例HGA的临床表现

4.2 诊断与鉴别诊断〔7,11〕对有类似于感冒症状的发热病人,特别是有血小板减少和白细胞减少,并有蜱接触史者,应当考虑到HGA。HGA需与其它的蜱媒病原体所致的发热性疾病相鉴别,其它的蜱媒病原体感染一般无血小板减少。HGA的临床特征和临床诊断要点与HME基本相同,它们之间的相互鉴别早期主要依赖病原学检查,后期可通过血清学方法进行鉴别。

因为肩突硬蜱为HGA和莱姆病的共同传播媒介,其可以同时携带嗜吞噬细胞无形体和莱姆病螺旋体,它的叮咬也可使人同时患有HGA和莱姆病。在用四环素类药物治疗无效时应考虑病人是否有莱姆病或其它病原体感染。某些病毒性感染也可以导致白细胞、血小板减少,因此需要与这些病毒性感染相鉴别。HGA的确诊有赖于多聚酶链反应(PCR)、血清学、病原分离等实验室诊断。

5 实验室检查

5.1 一般检查 绝大多数的HGA病例有血小板减少和多伴有白细胞减少,绝大多数病例有血清肝转氨酶水平升高。

5.2 直接涂片镜检 取病人的外周血直接涂片,作Wright's、Diff-Quik或 Giemsa染色,可发现 HGA病人的中性粒细胞胞质中有圆形桑椹状包涵体(Morula)。感染早期(第1w)检查中性粒细胞内包涵体是最有效的早期 HGA诊断方法,阳性率在25%～ 75%〔4,7,11〕。

5.3 血清学检测 用嗜吞噬细胞无形体感染的HL-60细胞制备抗原片作间接免疫荧光分析(IFA),检测病人血清中的抗嗜吞噬细胞无形体特异性抗体滴度。但是在感染的早期,大部分病人的检测结果为阴性,因此该方法检查结果无早期诊断价值〔4,7,11〕。

5.4 PCR检测 采用套式PCR扩增病人血标本中的嗜吞噬细胞无形体的16S rRNA基因片段,多数HGA病人的急性期血标本检测为阳性〔15〕。

5.5 病原体分离 将病人的抗凝血或从血中分离的白细胞接种于含有H L-60细胞悬液,大约1w后,经细胞涂片染色,可见细胞内有小包涵体,2w后几乎100%细胞被嗜吞噬细胞无形体感染〔4,7〕。

6 治疗与预防

HGA的治疗首选强力霉素,其它四环素类药物也有效。大多数患者用强力霉素治疗后2d内开始退热。体外药物敏感试验发现在HL-60细胞内的嗜吞噬细胞无形体除对强力霉素敏感外,利福平、环丙沙星、氧氟沙星等药物对它也有好的杀伤作用〔4,7,11〕。

HGA预防主要是在野外防止蜱对人的叮咬,可采用适当的杀虫剂杀灭居住地的蜱和宠物身上的蜱〔7,11〕。

〔1〕Chen SM,Dumler JS,Bakken JS,et al.Identification of a granulocyticEhrlichiaspecies as the etiologic agent of human disease〔J〕.J Clin Microbiol,1994;32：584-595.

〔2〕Goodman JL,Nelson C,Vitale B,et al.Direct cultivation of the causative agent of human granulocy tic ehrlichiosis〔J〕.New Eng J M ed,1996,334：209-215.

〔3〕Dumler JS,Barbet AF,Bekker CP,et al.Reorganization of genera in the families rickettsiaceae and anaplasmataceae in the order rickettsiales：unification of some species ofEhrlichiawithAnaplasma,CowdriawithEhrlichiaandEhrlichiawithNeorickettsia,descriptions of six new species combinations and designation ofEhrlichia equiand HGE agent'as subjective synonyms ofEhrlichia phagocy tophila〔J〕.Int J Syst Evol Microbiol,2001,51：2145-65.

〔4〕Bakken JS,Krueth J,Wilson-Nordskog C,Tilden RL,et al.Clinical and laboratory characteristics of human granulocy tic ehrlichiosis〔J〕.JAMA,1996,275：199-205.

〔5〕Wen B,Cao W,Pan H.Ehrlichiaeand Ehrlichial diseases in China〔J〕.A nn N Y Acad Sci,2003,900：45-53.

〔6〕Ijdo JW,Sun W,Zhang Y,et al.Cloning of the gene encoding the 44-kilodalton antigen of the agent of human granulocytic ehrlichiosis and characterization of the humoral response〔J〕.Infect Immun,1998,66：3264-3269.

〔7〕Dumler JC,Madigan JE,Pusterla N,et al.Ehrlichoses in humans：epidemiology,clinical presentation,diagnosis,and treatment〔J〕.Clin Infect Dis,2007,45 Suppl 1：S45-51.

〔8〕Walker DH,Dumler JS.Emergence of the ehrlichioses as human health problems〔J〕.Emerg Infect Dis,1996,2 ：18 29.

〔9〕Zhang L,Liu Y,Ni D,et al.Nosocomial transmission of human granulocy tic anaplasmosis in China〔J〕.JAMA,2008,300：2263-2270.

〔10〕Zhan L,Cao WC,Jiang JF,et al.Anaplasma phagocytophilumfrom Rodents and Sheep,China〔J〕.Emerg Infect Dis,16 ：724-768.

〔11〕Ismail N,Bloch KC,McBride JW.Human Ehrlichiosis and Anaplasmosis〔J〕.Clin Lab M ed.2010 Mar;30(1)：261-92.

〔12〕Banerjee R,A nguita J,Roos D,et al.Cutting edge：infection by the agent of human granulocy tic ehrlichiosis prevents the respiratory burst by down-regulating gp91phox〔J〕.J Immumol,2000,164：3947-3949.

〔13〕M ott J,Rikihisa Y.Human granulocytic ehrlichiosis agent inhibits superoxide anion generation by human neutrophils〔J〕.Infect immune,2000,68：6697-6703.

〔14〕Nartin ME,Caspersen K,Dumler JS.Immunopathology and ehrlichial propagation are regulated by interferon-γand interleukin-10 in a murine model of human granulocytic ehrlichiosis〔J〕.AJP,2001,158：1881-1888.

〔15〕Anderson BE,Sumner JW,Dawson JE,et al.Detection of the etiologic agent of human ehrlichiosis by polymerase chain reaction〔J〕.J Clin Microbiol,1992,30 ：775-80.